Caracterização da fotofísica e comportamento ácido-base de derivados da fluoresceína e rodamina

Abstract

Sondas fluorescentes são desde há muito utilizadas para caracterizar vários tipos de sistemas. Este trabalho centra-se no estudo de duas sondas fluorescentes pertencentes à família dos xantenos, a fluoresceína e a rodamina. Os xantenos são sondas fluorescentes muito utilizadas na área da química, biologia e medicina devido ao seu elevado rendimento quântico de fluorescência na região do visível e sensibilidade às propriedades do meio envolvente. Este trabalho tem como objetivo perceber melhor de que maneira o efeito combinado, das interações com o meio e do pH, pode afetar a estabilidade e o equilíbrio das diferentes espécies ácido-base das sondas, principalmente quando ligadas a proteínas. Neste estudo a fluoresceína e a tetrametilrodamina foram ligadas covalentemente à BSA, através dos resíduos de cisteína. Para melhor compreensão das propriedades das sondas quando ligadas à proteína, efetuou-se previamente a ligação destas ao aminoácido cisteína. O efeito da polaridade do meio nas propriedades destes derivados foi caracterizado mediante o estudo do comportamento em soluções aquosas com diferentes percentagens de etanol. O comportamento ácido-base das sondas foi caracterizado através de variações na sua absorção e fluorescência. Como esperado, observa-se uma estabilização da espécie neutra com a diminuição da polaridade do meio. Estes estudos experimentais foram também acompanhados por cálculos teóricos de previsão de espectros de absorção. A caracterização da fluoresceína ligada à BSA mostra que o meio envolvente apresenta propriedades semelhantes a misturas aquosas com 30 a 40 % de etanol.Os bioconjugados sintetizados (Fluoresceína-BSA e Rodamina-BSA) foram utilizados para estabilizar nanodroplets formadas em misturas aquosas de perfluoropentano, um sistema promissor em aplicações médicas como agente de entrega de fármacos ou agente de contraste para imagiologia. Estes sistemas foram caracterizados relativamente à sua estrutura e dinâmica, utilizando citometria de fluxo e microscopia confocal. A sua potencial utilização como agentes para encapsulação e libertação controlada de agentes bio-activos foi ainda avaliada mediante a capacidade de incorporação de sondas fluorescentes no seu centro apolar e interface.

Fluorescent probes have long been used to characterize various types of systems. This work focuses on the study of two fluorescent probes belonging to the family of xanthenes, fluorescein and rhodamine. Xanthenes are fluorescent probes widely used in the area of chemistry, biology and medicine due to their high quantum fluorescence yield in the visible region and sensitivity to the properties of the environment. This work aims to better understand how the combined effect, of interactions with the environment and pH, can affect the stability and balance of the different acid-base species of the probes, especially when linked to proteins.In this study, fluorescein and tetramethylrhodamine were covalently linked to BSA through cysteine residues. In order to better understand the properties of the probes when linked to the protein, these properties were previously linked to the amino acid cysteine. The effect of the polarity of the medium on the properties of these derivatives was obtained by studying the behavior in aqueous solutions with different percentages of ethanol. The acid-base of the probes was developed according to the variations in their absorption and fluorescence. As expected, there is a stabilization of the neutral species with a decrease in the polarity of the medium. These experimental studies were also accompanied by theoretical calculations of prediction of absorption spectra. The characterization of BSA-linked fluorescein shows that the environment has properties similar to aqueous mixtures with 30 to 40% ethanol.The synthesized bioconjugates (Fluorescein-BSA and Rhodamine-BSA) were used to stabilize nanogrooves formed in aqueous mixtures of perflenapent, a promising system in medical applications as a drug delivery agent or contrast agent for imaging. These systems were characterized in terms of their structure and dynamics, using flow cytometry and confocal microscopy. Its potential use as agents for encapsulation and controlled release of bioactive agents was further evaluated by the ability to incorporate fluorescent probes into its nonpolar center and interface.