Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/93154
Title: Characterization of Salivary Metabolic Profiles in Early Childhood Caries (ECC): Diagnostic, Preventive and Therapeutic Implications
Authors: Pereira, Joana Leonor Sousa Almeida 
Orientador: Costa, Ana Luísa Moreira
Gil, Ana Maria Pissarra Coelho
Keywords: cárie precoce da infância; saliva; metabolómica; crianças; biomarcadores; early childhood caries; saliva; metabolomics; children
Issue Date: 7-Feb-2020
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Introdução: A cárie precoce da infância (ECC), doença de elevada prevalência com consequências significativas em crianças de idade pré-escolar, é atualmente considerada um problema de saúde pú- blica mundial. A inexistência de preditores de risco consistentes, bem como os desafios inerentes ao tratamento, constituem claras limitações em termos de abordagem e geram uma demanda eminente na definição de novas estratégias que permitam a sua predição e/ou diagnóstico precoce. Ainda que as potencialidades diagnósticas do metaboloma salivar tenham conduzido a relevantes progressos médicos, a aplicação desta abordagem no contexto da investigação em ECC permanece ainda parca- mente explorada. O presente trabalho teve como objetivo primário pesquisar o impacto metabólico da ECC na saliva de crianças através de um estudo observacional longitudinal de larga escala, visando a identificação de perfis metabolómicos associados à presença ou progressão da ECC. Com este intuito realizou-se um estudo piloto prévio objetivando estabelecer um protocolo de colheita salivar adequado a estudos metabolómicos e a avaliar preliminarmente o impacto relativo do género, estadio de dentição e cárie dentária no metaboloma salivar de uma coorte pequena de crianças. Em paralelo, procedeu-se à caracterização da prevalência e gravidade de ECC na coorte principal e explorou-se a associação da doença com características sociodemográficas e de comportamentos relativos à saúde oral dos participantes. Materiais e métodos: Conduziu-se inicialmente um estudo piloto transversal numa amostra de crian- ças saudáveis (4-16 anos, n=38) com o intuito de comparar os efeitos de: (a) estimulação e ausência de estimulação salivar, e (b) colheita através de salivação passiva (PD) e de um dispositivo absorvente no metaboloma salivar, usando espetroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN, 500 MHz). No estudo principal procedeu-se à observação oral e à colheita de amostras de saliva não estimulada (USS) de uma coorte de crianças saudáveis (5 anos, n=77 controlos e n=45 participantes com ECC) de jardins de infância do distrito de Coimbra, em dois períodos de avaliação (aos 0 e 6 meses). Os estudos cumpriram os requisitos éticos e legais exigidos. A colheita e processamento das amostras salivares realizou-se sob condições estandardizadas. A avaliação clínica oral foi efetuada por uma Médica dentista experiente, sujeita a calibração prévia, e seguiu os critérios de diagnóstico ICDAS-II, bem como práticas de prevenção de contaminação cruzada. Procedeu-se ainda à colheita de dados sociodemográficos e de comportamentos relacionados com a saúde oral.As amostras salivares foram analisadas por 1H-RMN, sendo que, atendendo a restrições temporais do presente estudo, apenas os dados de 1H-RMN da avaliação inicial foram sujeitos a análise estatística multivariada e univariada, nesta dissertação. Os dados clínicos, sociodemográficos e comportamentais foram analisados por métodos univariados. Resultados: Não se detetaram diferenças significativas entre as composições da USS e da saliva esti- mulada (SS), e a USS foi escolhida para os estudos seguintes. O uso do dispositivo absorvente induziu alterações composicionais significativas, tendo-se considerado o PD como o método preferencial de colheita. No estudo piloto, os potenciais efeitos de confusão do género e estádio de dentição foram residuais em comparação ao impacto da cárie, que induziu variações nos níveis de 21 metabolitos, sobretudo aminoácidos e monossacarídeos.Na coorte principal,as possíveis variáveis de confusão não produziram efeitos detetáveis no metaboloma salivar. Nenhuma das alterações significativas associadas a cárie verificadas no estudo piloto foi confirmada nas amostras da primeira colheita nesta coorte. Surpreendentemente, verificou-se uma variação significativa nos níveis de alanina entre controlos e Characterization of salivary metabolic profiles in early childhood caries (ECC) xi crianças com ECC. Crianças do sexo masculino na fase mista da dentição com ECC apresentaram níveis elevados de alanina, enquanto que participantes do sexo feminino com lesões em dentina na mesma fase da dentição exibiram níveis aumentados deste metabolito. Detetaram-se ainda tendên- cias qualitativas envolvendo alguns metabolitos, um dos quais a dimetilsulfona, que havia apresentado uma variação significativa no estudo piloto. Na avaliação inicial, a prevalência de ECC e o valor médio do índice de dentes cariados, perdidos e obturados (dA-6mft) foram 40.10% e 1.62 ± 2.52 (n=142), enquanto que aos seis meses foram 46.50% e 1.54 ± 2.54 respetivamente (n=114). O componente cariado contribuiu 80.40% e 63.40% para o dA-6mft na primeira e na segunda avaliações, respetiva- mente. A implementação de hábitos de escovagem dentária e a escovagem bi-diária encontraram-se inversamente relacionados com a ECC, e verificou-se uma associação significativa entre a ingestão diária de doces e a doença nesta coorte. Conclusões: O presente estudo inclui a caracterização mais completa do metaboloma da USS de crianças já realizada por NMR e representa um válido contributo para o conhecimento acerca dos protocolos de colheita de saliva para estudos de NMR. Um perfil composto por 21 metabolitos, indi- cativo de hidrólise proteica e de desglicosilação foi, pela primeira vez associado à presença de cárie no metaboloma de USS de crianças,apesar de este achado não ter sido confirmado na coorte de maiores dimensões, por possíveis razões que serão nesta tese discutidas. Interessantemente, verificou-se uma variação de alanina, estando a direção da mesma aparentemente associada ao género, por motivos não inteiramente conhecidos.Apesar das limitações do trabalho no que respeita as dificuldades inerentes ao desenvolvimento de um estudo observacional numa amostra de crianças simultaneamente de grandes dimensões e bem definida, sob condições bem controladas, os resultados obtidos consubstanciam as potencialidades da metabolómica salivar no contexto da investigação em ECC, sendo que a realização adicional de estudos longitudinais em amostras de grandes dimensões se assume fundamental.
Introduction: Early childhood caries (ECC), a widely prevalent disease with devastating consequences on young children, is currently considered a worldwide public health burden. The lack of consistent ECC risk predictors, along with the challenges regarding its care, has hindered ECC’s management and generated a clear demand for new strategies enabling disease prediction and/or earlier diagnosis. Although the knowledge that saliva’s metabolome is a potentially informative mirror of homeostasis has led to major developments in many medical fields, the application of this approach regarding ECC still remains largely unexplored.The present work sought to characterize the metabolic impact of ECC in children’s saliva through the development of a large-scale longitudinal observational study, aiming to search for a metabolomic profile specifically associated to ECC’s presence or clinical stages.To achieve this, a pilot study was previously conducted to establish a saliva collection protocol suitable for me- tabolomic research and to preliminary gauge the relative impacts of gender, dentition stage, and caries on the saliva metabolome in a small children cohort.Additionally,ECC’s prevalence and severity were determined in the main study participants and the association between the disease and sociodemo- graphic and oral health related behavior characteristics of the subjects was studied. Material and methods: A cross-sectional pilot study of saliva from healthy children (4-16 years old, n=38) was firstly conducted to compared the effects of: (a) stimulation and unstimulation conditions, and (b) collection through passive drool (PD) and using an absorbing device in the salivary metabolome of children,usinganuclearmagneticresonance (1H-NMR,500MHz)metabolomicsapproach.Inthemain study, oral examination and collection of unstimulated saliva (USS) were performed in a five-year-old healthy cohort (n=77 controls and n=45 ECC-afflicted) from preschools in Coimbra,in two evaluation periods (initially and after 6 months). Both studies met all ethical and legal requirements for human research. Saliva samples collection and handling were performed under strictly standardized conditions. A calibrated and experienced dentist performed oral examinations according to ICDAS-II diagnostic criteria and all recommendations regarding prevention of contamination and cross-contamination were followed.Metadata on sociodemographic and oral health related behavior variables of participants were also collected. Salivar y samples were analyzed through 1H-NMR, for only data from baseline evaluation was subjected to multivariate and univariate analysis in the present dissertation,due to time constraints of this research. Metadata was assessed by univariate statistical methodologies. Main results: No significant compositional differences were found between USS and stimulated saliva (SS), and the former was used for subsequent studies. Swab collection induced significant changes in sample composition, indicating PD as preferential. In the pilot cohort, the confounding effects of gen- der and dentition stage were found to be minimal when compared to that of the dental caries, which induced variations in the levels of 21 metabolites, mostly amino acids and monosaccharides. In the main study, possible confounding variables were not shown to produce detectable compositional trends. None of the caries-related significant variations detected in the pilot study could be confirmed in the baseline samples from the larger cohort. Interestingly, alanine was found varying significantly between controls and ECC cases. ECC-afflicted males in mixed dentition exhibited lower alanine levels, whilst females with ECC lesions in dentin in the same dentition phase presented increased amounts of this metabolite. Qualitative tendencies regarding increased levels of some metabolites in ECC were also detected and these trends included a dimethylsulfone variation, previously seen varying significantly in our pilot study. At baseline, ECC prevalence and average decayed/missing/filled teeth score (dA-6mft) Characterization of salivary metabolic profiles in early childhood caries (ECC) xiii were 40.10% and 1.62 ± 2.52 (n=142), whilst at the six-month evaluation rates of 46.50% and 1.54 ± 2.54 were found (n=114).The decayed component contributed for 80.40% and 63.40% of the dA-6mft in the first and second evaluation, respectively. Establishment of toothbrushing habits before one year of age and twice daily toothbrushing were inversely associated to ECC and a significant association between daily ingestion of sweets and the disease was also detected within the cohort. Conclusions: This study presents the most comprehensive characterization of children’s USS metabo- lome by 1H-NMR to date, and to the best of our knowledge, and contributes to fill in relevant gaps regarding saliva collection protocols for 1H-NMR-based studies in pediatric populations. A 21-metabolite profile indicative of protein hydrolysis and deglycosylation was, for the first time to our knowledge, found in children’s USS metabolome associated to caries, although the putative hypotheses advanced were not further confirmed in the larger cohort, due to possible reasons discussed later in this thesis. Strikingly,anovelobservationregardingalaninevariationwasseenandthedirectionofwhichappeared to be related to gender, for reasons not entirely understood. Despite the limitations of this work, in particular the difficulties inherent to conduct an observational study with a large yet strictly defined cohort of children under well-controlled conditions, our findings confirm the potentialities of saliva metabolomics in ECC research and further longitudinal investigations with large cohorts is warranted.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, ramo de Medicina Dentária, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/93154
Rights: openAccess
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