Development of an analytical technique for the quantification of anti-epileptic drugs in saliva as a new toll for therapeutic monitoring of epileptic patients.

Abstract

A epilepsia é uma das doenças neurológicas mais comuns, afetando aproximadamente 1% da população mundial. Caracteriza-se pela ocorrência de convulsões recorrentes e espontâneas, provocadas por um desequilíbrio entre os sistemas excitatórios e inibitórios cerebrais. Atualmente, o principal objetivo do tratamento é reduzir a ocorrência das convulsões, melhorando a qualidade de vida dos doentes. Existem dezenas de fármacos antiepiléticos disponíveis na clínica para controlar/prevenir as crises epiléticas e prevenir a evolução da doença. No entanto, o número de doentes que continua a não responder ao tratamento é elevado. Para além disso, uma elevada variabilidade farmacocinética inter- individual tem demostrado a importância da monitorização da terapêutica, de forma a individualizar a terapêutica. As principais matrizes biológicas utilizadas na monitorização terapêutica de antiepiléticos são o plasma e o soro. Contudo, o uso destas matrizes requer profissionais especializados para fazer a colheita, constituindo um obstáculo à recolha de amostras em ambulatório. Desta forma, a saliva pode ser uma excelente alternativa, pois a sua recolha é simples e rápida, o próprio doente pode recolher a amostra, promovendo a adesão dos doentes aos estudos de monitorização terapêutica de fármacos. Mais ainda, torna possível a recolha de amostra em doentes com dificuldade de acesso venoso, como os idosos e doentes epiléticos antes, durante ou após uma crise epilética.O presente trabalho consistiu no desenvolvimento e validação, de acordo com as diretrizes internacionais, de uma técnica de cromatografia líquida de elevada resolução (HPLC) com deteção de fotodíodos (DAD) para quantificar com exatidão e precisão a carbamazepina, carbamazepina-10,11-époxido, S-licarbazepina, lacosamida e levetiracetam em amostras de saliva. A técnica revelou ser linear nas gamas entre 0,2–6 mg/L para a carbamazepina e carbamazepine-10,11-époxido, 0,3–9 mg/L para a S-licarbazepina, 1–30 mg/L para a lacosamida e 0,8–24 mg/L para o levetiracetam. Os valores de exatidão variaram entre -14,76 a 9,35% e - 12,87 e 11,18% para os valores de intra e inter-dia, respetivamente. No caso da precisão, os valores de intra-dia estiveram entre os 3,45 to 10,76% e os de inter-dia entre 3,85 to 13,05%. Os valores de recuperação foram reprodutíveis (73,46–90,16% para os controlos de qualidade de baixa concentração e 78,19–90,76% para os controlos de qualidade de alta concentração). Para além disso, as amostras de saliva mostraram-se estáveis à temperatura ambiente durante 72h (87,12–113,19%), criando a oportunidade de implementar a recolha de saliva em ambulatório com o subsequente transporte para o laboratório onde a amostra é analisada. Com esta nova estratégia, espera-se aumentar o número de doentes incluídos nos estudos de monitorização da terapêutica e investigar a correlação entre as concentrações de saliva, efeitos adversos e terapêuticos e otimização do regime terapêutico.Uma vez validada, a técnica foi utilizada para quantificar os antiepiléticos supramencionados na saliva de doentes epiléticos internados no Centro de Epilepsia Refratária do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC EPE, Coimbra). Em simultâneo, os fármacos foram também quantificados em plasma. Os resultados obtidos mostraram uma correlação estatisticamente significativa (p < 0,05) entre as amostras de plasma e saliva de carbamazepina (r2 = 0,6013; r = 0,7754), carbamazepina-10,11-epóxido (r2 = 0,9062; r = 0,9520), S-licarbazepina (r2 = 0,7980; r = 0,8933) e de levetiracetam (r2 = 0,7468; r = 0,8642). Relativamente à lacosamida, e apesar de haver evidência de as concentrações plasmáticas se correlacionarem com as salivares (r = 0,8543; r2 = 0,7298), o número de amostras foi bastante baixo (n = 4).Estes resultados preliminares sugerem a possibilidade de implementar a monitorização terapêutica da carbamazepina, carbamazepina-10,11-epóxido, S-licarbazepina, lacosamida e levetiracetam em amostras de saliva humana. Esta será uma estratégia promissora para estabelecer o intervalo de concentrações terapêuticas individuais destes fármacos e avaliar a adesão à terapêutica.

Epilepsy is one of the most prevalent neurological disorders, affecting approximately 1% of the world population. It is a state of recurrent and unprovoked seizures, due to an imbalance in the excitatory and inhibitory neuronal systems of the brain. The main goal of epilepsy treatment is to reduce the occurrence of seizures and give the best quality of life to patients. There are dozens of anti-epileptic drugs (AEDs), but the number of patients who do not respond to treatment remains significant. Furthermore, high pharmacokinetic inter- individual variability has shown the importance of therapeutic drug monitoring (TDM) in order to individualize drug posology. Plasma and serum are the main biological matrices applied for TDM of AEDs. Nevertheless, the necessity of a specialized professional to collect the samples has been an obstacle to sample collection in ambulatory. Therefore, saliva can be an excellent alternative to be easily applied in ambulatory. It is simpler and faster to collect, promoting patients’ compliance. Moreover, saliva sample collection avoids complications associated to patients with difficult venous access, such as elderly and epileptic patients during seizures.Herein, a high-performance liquid chromatographic (HPLC) technique with diode-array detection (DAD) was developed and full validated according to international guidelines, in order to quantify carbamazepine, carbamazepine-10,11-epoxide, S-licarbazepine, lacosamide and levetiracetam in saliva. The technique was linear in the following concentrations ranges: 0.2–6 mg/L for carbamazepine and carbamazepine-10,11-epoxide, 0.3–9 mg/L for S- licarbazepine, 1–30 mg/L for lacosamide and 0.8–24 mg/L for levetiracetam. Accuracy values ranged from -14.76 to 9.35% and -12.87 and 11.18%. in intra-day and inter-day analysis, respectively. Intra-day values of precision varied between 3.45 to 10.76% and inter-day values ranged from 3.85 to 13.05%. Reproducible recovery yields were achieved (73.46–90.16% for the low quality control and 78.19–90.76% for the high quality control). Moreover, the high stability of saliva samples at room temperature during 72h (87.12–113.19%) creates the opportunity to implement saliva collection in ambulatory with subsequent transport of samples to the laboratory for analysis. This new strategy is expected to increase the number of patients subjected to TDM and investigate the correlation between saliva concentrations, therapeutic and adverse effects and optimize drug posology.The validated technique was subsequently applied to saliva samples of epileptic patients admitted to the Refractory Epilepsy Centre of Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC EPE, Coimbra). Simultaneously, plasma samples were determined for the same patients and correlated with saliva concentrations. The obtained results showed a statistically significant correlation (p < 0.05) between plasma and saliva concentrations for carbamazepine (r2 = 0.6013; r = 0.7754), carbamazepine-10,11-epoxide (r2 = 0.9062; r = 0.9520), S- licarbazepine (r2 = 0.7980; r = 0.8933) and levetiracetam (r2 = 0.7468; r = 0.8642). Regarding lacosamide, even though there is evidence of correlation (r = 0.8543; r2 = 0.7298), the number of samples were small (n = 4) and statically evidence was not found.These preliminary results support the implementation of TDM of carbamazepine, carbamazepine-10,11-epoxide, S-licarbazepine, lacosamide and levetiracetam in human saliva samples. This would be a simple and promising approach to establish the individual therapeutic range of those AEDs and assess drug compliance.