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Title: The role of telomere maintenance in urological malignancies
Authors: Leão, Ricardo Romão Nazário 
Orientador: Figueiredo, Arnaldo
Castelo Branco, Pedro
Tabori, Uri
Keywords: Biomarcadores; Cancro da próstata; Cancro do testículo; Cancro da bexiga; Telomerase; Telómeros; Metilação do promotor da TERT; Mutações do promotor da TERT; Mecanismos alternativos de alongamento dos telómeros
Issue Date: 22-Jan-2019
Project: FCT SFRH/BD/102232/2014 
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: New breakthroughs in cancer research have yielded potentially curative cancer therapies, including for urologic malignancies. However, while these developments spell new hope for many patients, a complete understanding of the disease is still far. Biomarkers capable of predicting the natural history of cancer disease are increasingly needed in order to tailor medical intervention. Cancer, a cellular “demonic evil growth”, is driven by the acquisition of multiple molecular abnormalities, but it is exclusively dependent on molecular processes that lead to the maintenance of telomeres. In neoplastic cells, the process of maintaining telomeres is controlled by telomerase in 85-90% of the cases, and by alternative (non-telomerase- -dependent) mechanisms in the other 10% to 15%. Both mechanisms are responsible for unlimited cellular self-renewal (a hallmark of cancer) (Hanahan & Weinberg, 2011). The role of telomeres is well established as an important driving force in preventing chromosomal and genomic instability. However, the complete understanding of mechanisms responsible for telomere maintenance and their potential diagnostic and prognostic value remain uncertain. The study of the mechanisms by which telomeres are maintained in cancer cells will allow a better understanding of the biology of telomeres in cancer and may recognize possible therapeutic targets that might prevent genetic instability and cancer-cell immortalization. Simultaneously, knowing that the progression of cancer disease does not occur without cellular immortality, the mechanisms responsible for the maintenance of telomeres might provide important information in terms of the natural history of the different oncological diseases and potentially be used as cancer biomarkers. Consequently, the main objective of our study was to examine the prevalence of different telomere maintenance mechanisms [either by their contribution to telomerase activation or in a telomerase-independent manner (alternative lengthening of telomeres – ALT] and their diagnostic and prognostic properties in urological malignancies, such as prostate, bladder and testicular cancer. In what concerns to prostate cancer, the mechanisms leading to telomerase activation have not been yet described. In our study, we analyzed the levels of DNA methylation of a specific region within the telomerase (TERT) promoter, composed of 5 CpG sites and which our group defined as THOR (TERT Hypermethylated Oncological Region). We observed, for the first time, that differential methylation in this region has diagnostic properties and is associated with the disease aggressiveness. In addition, THOR showed prognostic properties and, whenever hypermethylated, it was a risk factor for biochemical recurrence in patients with lower-risk prostate cancer (HR: 3.68; 95% CI 1.18 to 11.50). Contrarily to prostate cancer, a specific TERT regulator mechanism was previously identified in urothelial bladder cancer (UBC). UBC are known to undergo telomerase reactivation in up to 90% of the cases and non-coding mutations of the TERT promoter (TERTpMut) have been causally implicated. In our study, we questioned not only the role of these genetic alterations, but also the involvement of epigenetic mechanisms (THOR methylation) in the expression of telomerase and its association with clinical outcomes. Our results demonstrated that TERTpMut are early events in UBC and THOR methylation is a dynamic mechanism involved in the tumorigenesis influencing the history of the disease. Interestingly, we have found that genetic and epigenetic mechanisms may be simultaneously present in the same tumor and, when combined, the resulting effect leads to increased telomerase expression and an increased risk for disease progression. Therefore, the combined molecular alterations of the TERT promoter (THOR hypermethylated, THORhigh and TERTpMut) comprise a risk factor for disease recurrence (HR:5.12, 95% CI 2.3 to 11.3 p<0.0001) and disease progression (HR: 3.92; 95% CI 1.2 to 13.0, p= 0.026) in non-muscle invasive bladder cancers (NMIBC). These results highlight important aspects: the frequency of TERT promoter mutations is quite high and the combined action of the genetic and epigenetic mechanisms on the TERT promoter provides a new and important insight into the biology of telomeres with implications for clinical outcomes. Testicular cancer is not as common as prostate and bladder cancer, and characteristically affects younger patients. Like the other tumors studied, it is also known to be a TERT- -dependent tumor, but with unique and distinct characteristics – it is a heterogeneous germ cell tumor (inter- and intra-tumoral heterogeneity) and displays alternative mechanisms to maintain telomeres (ALT). In this chapter, we have chosen a more comprehensive methodology, including not only the study of telomere maintenance mechanisms. After reflecting on the clinical needs for biomarkers at different stages of testicular cancer, we focused our attention on the identification of biomarkers for advanced nonseminomatous disease since there is an imperative need to identify biomarkers capable of predicting the histology of post-chemotherapy residual lesions and sparing these patients from significant morbid surgeries. Therefore, our first approach focused on the creation of a clinical model capable of predicting the presence of benign lesions (necrosis and/or fibrosis). Our model (Princess Margaret Model) was based on the exclusive use of clinical variables (presence of teratoma histology in the primary, AFP, dimension of residual disease and its variations with chemotherapy treatment) and allows predicting the presence of benign histology with high accuracy (C index 0.82) and sensitivity (99.3%), improving previous results by other groups. Subsequently, we focused our attention on the mechanisms of telomere maintenance in testicular germ cell tumors (TGCT) and its association with histological heterogeneity and clinical outcomes. These tumors are characteristically heterogeneous and telomerase expression levels are simultaneously elevated in tumor and normal tissues (without cancer cells) in contradiction to other types of cancer. The expression of telomerase is dissimilarly elevated according to histology (elevated in embryonal carcinomas and absent in teratomas, comprising inter-tumoral heterogeneity) and does not depend on mechanisms associated with cancer for its activation (mutations of the TERT promoter and THOR are absent). The most striking finding was related to the concomitant recruitment of telomerase and alternative mechanisms of telomere maintenance (ALT) in some nonseminoma lesions. This observation suggests intra-tumor heterogeneity and allows us to propose a hypothesis for the maturation of testicular lesions implicating telomere biology; a continuous process between telomerase activation and alternative mechanisms that may accompany the maturation process of embryonic lesions into teratomas. Lastly, with emphasis on the demands of 21st century Medicine, we have questioned the properties of a serum marker – liquid biopsies – in patients with advanced testicular nonseminomatous germ cell tumors (NSGCT). As for the clinical model, we were interested in evaluating the ability to predict the histology of residual retroperitoneal disease. We interrogated the role of serum epigenetic markers (miRNA) as predictive tools for viable residual disease after chemotherapy. MiR-371a-3p demonstrated high discriminative capacity for viable disease (AUC 0.874, 95% CI 0.77-0.97). This is the first molecular, non-invasive method to determine the presence of viable disease post-chemotherapy in NSGCT patients with negative findings on traditional serum protein biomarkers (AFP, HCG) and residual disease on imaging. Future prospective validation of this discover might change the current paradigm of advanced testicular cancer treatment. The results obtained in this thesis provide important information in terms of telomere biology and highlight the role of the mechanisms responsible for its maintenance as biomarkers with diagnostic and prognostic properties. These results allow a better understanding of tumor biology and provide insight about the interaction between mechanisms related to telomerase activation and alternative mechanisms of telomere maintenance, which might unveil possible means to prevent the acquisition of aberrant self-renewal capacity that characterizes cancer.
Os recentes avanços da investigação em cancro (incluindo na urologia oncológica) têm resultado em novas terapêuticas potencialmente mais efectivas. No entanto, enquanto estes desenvolvimentos significam novas esperanças para muitos doentes, a completa compreensão da doença está ainda distante. Novos biomarcadores capazes predizer a história natural da doença são necessários para orientar de modo preciso e personalizado a intervenção médica. O cancro, um "crescimento celular demoníaco", é resultado da aquisição de múltiplas alterações moleculares, no entanto, é exclusivamente dependente de processos moleculares que levam à manutenção dos telómeros. Em células neoplásicas, o processo de manutenção dos telómeros é controlado pela telomerase (TERT) em 85-90% dos casos, e por mecanismos alternativos (não dependentes da telomerase) nos outros 10% a 15%. Ambos mecanismos são responsáveis pela proliferação celular ilimitada – uma das marcas do cancro (Hanahan & Weinberg, 2011). Os telómeros são crucias na prevenção da instabilidade genómica e cromossómica. No entanto, o completo conhecimento dos mecanismos responsáveis pela manutenção dos telómeros e o seu potencial valor diagnóstico e prognóstico em doenças oncológicas permanecem indefinidos. O estudo dos mecanismos pelos quais os telómeros são mantidos, poderá permitir uma melhor compreensão da sua biologia e identificar possíveis alvos terapêuticos que possam impedir a instabilidade genómica e consequentemente evitar a imortalização celular. Simultaneamente, sabendo que a progressão das doenças oncológicas não ocorre sem a imortalidade celular, os mecanismos responsáveis pela manutenção dos telómeros podem fornecer informações importantes em termos da história natural da doença e potencialmente serem usados como biomarcadores. Assim, o nosso estudo teve por objectivo principal examinar a prevalência de diferentes mecanismos de manutenção dos telómeros [mecanismos responsáveis pela activação da telomerase e mecanismos alternativos independentes da telomerase (alongamento alternativo dos telómeros – ALT], e as suas propriedades diagnóstica e prognóstica em tumores urológicos (próstata, bexiga e testículo). No cancro da próstata não foram descritos, até à data, mecanismos responsáveis pela activação da telomerase. Neste estudo, analisámos os níveis de metilação do DNA de uma região específica do promotor da telomerase (TERT), composto por 5 sítios CpG e que o nosso grupo definiu como THOR (TERT Hypermethylated Oncological Region). Verificámos, pela primeira vez, que a metilação diferencial nesta região (THOR) tem propriedades diagnósticas e está associada à agressividade da doença. THOR revelou propriedades prognósticas e, quando hipermetilado, é um fator de risco para recidiva bioquímica em pacientes com cancro da próstata de menor risco (HR: 3,68; IC95% 1,18 a 11,50). Ao contrário do cancro da próstata, nos tumores uroteliais vesicais foi anteriormente identificado um mecanismo regulador da telomerase. A activação da telomerase é verificada em cerca de 90% destes tumores, e mutações não codificantes do promotor da telomerase (TERTpMut) são causalmente implicadas nesta activação. Neste estudo, questionámos não apenas o papel deste mecanismo genético (TERTpMut), mas também o envolvimento de mecanismos epigenéticos (metilação de THOR) na expressão da telomerase e na sua associação com resultados clínicos. Os resultados obtidos demonstraram que as mutações do promotor TERT são eventos precoces nos tumores uroteliais vesicais, e a metilação de THOR é um processo dinâmico envolvido na tumorigénese e com influência na história da doença. Curiosamente, descobrimos que estes mecanismos genéticos e epigenéticos podem estar simultaneamente presentes no mesmo tumor e, quando combinados, o efeito resultante traduz-se num aumento da expressão da telomerase e a um aumento do risco de progressão da doença. Assim, alterações moleculares simultâneas do promotor da TERT (THOR hipermetilado – THORhigh e presença de mutações do promotor da TERT – TERTpMut) constituem um fator de risco para recidiva (HR: 5,12; IC95% 2,3 a 11,3 p <0,0001) e progressão da doença (HR: 3,92; 95% CI 1,2 a 13,0; p = 0,026) em cancros da bexiga não músculo-invasivos. Estes resultados evidenciam aspectos importantes: a frequência de mutações do promotor TERT é bastante alta e a acção combinada dos mecanismos genéticos e epigenéticos no promotor TERT fornece uma nova e importante compreensão da biologia dos telómeros com implicações clínicas. O cancro de testículo não é tão comum quanto o cancro da próstata e da bexiga, e afecta caracteristicamente indivíduos mais jovens. Assim como os outros tumores estudados, o cancro do testículo é também dependente da TERT, mas com características únicas e distintas – é um tumor de células germinativas heterogéneo (heterogeneidade inter e intra--tumoral) e apresenta mecanismos alternativos para manter os telómeros (ALT). Neste capítulo, escolhemos uma metodologia mais abrangente, incluindo não apenas o estudo dos mecanismos de manutenção dos telómeros. Depois de refletir sobre as necessidades clínicas de biomarcadores em diferentes estágios do cancro testicular, concentrámos a nossa atenção na identificação de biomarcadores para doença não-seminomatosa avançada. Há uma necessidade imperativa em identificar biomarcadores capazes de predizer a histologia de lesões residuais pós-quimioterapia que permita poupar estes doentes a cirurgias de elevada morbilidade. Deste modo, a nossa primeira abordagem centrou-se na criação de um modelo clínico capaz de predizer a presença de lesões benignas (necrose e fibrose) em doentes com doença residual retroperitoneal pós quimioterapia. O nosso modelo (Princess Margaret Model) baseou-se no uso exclusivo de variáveis clínicas (presença de histologia de teratoma na lesão primária, AFP, dimensão da doença residual e suas variações com quimioterapia) e permite predizer a presença de histologia benigna (necrose e/ou fibrose) com elevada precisão (C índex 0,82) e sensibilidade (99,3%), melhorando os resultados anteriormente obtidos por outros grupos. De seguida, focámos a nossa atenção no estudo dos mecanismos de manutenção de telómeros em tumores testiculares de células germinativas (TTCG) e estudámos a sua associação com heterogeneidade histológica e resultados clínicos. Os TTCG são caracteristicamente heterogéneos, no entanto, a expressão da telomerase é simultaneamente elevada em tecido tumoral e tecido normal (sem evidência de células neoplásicas), em clara contradição com outros tipos de cancro. A expressão da telomerase é diferentemente elevada de acordo com a histologia (elevada em carcinomas embrionários e ausente em teratomas; revelando heterogeneidade inter-tumoral) e não depende de mecanismos associados ao cancro (mutações do promotor da TERT e THOR estão ausentes). O achado mais surpreendente está relacionado com o recrutamento simultâneo da telomerase e mecanismos alternativos de manutenção dos telómeros (ALT) em tumores não seminomatosos. Este achado sugere heterogeneidade intra-tumoral e permite-nos propor um modelo-hipótese para a maturação das lesões testiculares envolvendo a biologia dos telómeros; um processo contínuo entre a ativação da telomerase e mecanismos alternativos que acompanha o processo de diferenciação de carcinoma embrionário em teratomas. Por fim, dando ênfase às exigências e tendência da medicina do século XXI, questionámos as propriedades de um marcador sérico – biópsias líquidas – em doentes com tumores testiculares não-seminomatosos avançados. Tal como no modelo clínico, estudámos a capacidade de predizer a histologia da doença residual retroperitoneal após quimioterapia. Avaliámos um biomarcador epigenético sérico, miR-371a-3p, que demonstrou alta capacidade discriminativa para doença viável (AUC 0,874, IC 95% 0,77-0,97). MiR-371a-3p é o primeiro marcador molecular não invasivo que permite determinar com precisão a presença de doença residual viável pós quimioterapia em doentes com tumores testiculares não- -seminomatosos com marcadores clássicos (AFP e HCG) normais e doença residual identificada por imagem. A confirmação destes resultados em estudos prospectivos poderá mudar o actual paradigma do tratamento do cancro do testículo avançado. Os resultados obtidos nesta tese fornecem informações importantes em termos da biologia dos telómeros e realçam o papel dos mecanismos responsáveis pela sua manutenção como biomarcadores com propriedades diagnósticas e prognósticas. Estes resultados permitem uma melhor compreensão da biologia do tumor, fornecem informação sobre a interação entre os mecanismos relacionados com a activação da telomerase e mecanismos alternativos da manutenção dos telómeros, o que poderá permitir identificar formas possíveis de evitar a aquisição da capacidade de auto-renovação aberrante que caracteriza o cancro.
Description: Tese no âmbito do Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde, ramo de Medicina, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Rights: embargoedAccess
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