Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/92417
Title: Study on the contribution of the choroid to the pathophysiology of diabetic retinopathy
Authors: Figueiredo, António Campos
Orientador: Silva, Rufino Martins da
Ambrósio, António Francisco Rosa Gomes
Keywords: Choroid; Retina; Choroidal thickness; Diabetes; Macular edema; Inflammation; Glia; Pericytes; VEGFR2 Coroide; Retina; Espessura coroide; Diabetes; Edema macular; Inflamação; Glia; Pericitos; VEGFR2
Issue Date: 13-Nov-2020
Project: Fundação para a Ciência e Tecnologia, UID/NEU/04539/2013, UID/NEU/04539/2019, UIDB/04539/2020 and UIDP/04539/2020 
COMPETE-FEDER (POCI-01-0145-FEDER-007440) 
Centro 2020 Regional Operational Programme (CENTRO-01-0145-FEDER-000008: BrainHealth 2020 
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Background: Recent studies have reported that the choroidal thickness may be a prognostic factor for diabetic retinopathy and diabetic macular edema (DME), but there are conflicting results in the literature. Moreover, diabetic choroidopathy and the nature of diabetic retinopathy, including macular edema, have been recognized as complex traits, with an inflammatory component. Alterations in the choroid, such as vascular remodelling and capillary depletion of the choriocapillaris, and in the retina, as glial cell reactivity and migration, have been described in diabetic rats. However, there is no consensus about the role of baseline choroidal thickness as a prognostic factor in DME under treatment. Likewise, it is unknown how the choroidal thickness changes in animal models of diabetes, as well as the cellular and molecular alterations occurring simultaneously in the choroid and retina in diabetes. Purpose: To determine the prognostic value of choroidal thickness and to search other prognostic factors in patients with DME. To evaluate the choroidal thickness and changes in cellular and molecular signatures in the choroid and retina in the course of diabetes, in animal models of Type 1 and Type 2 diabetes. Methods: In a prospective study, 126 eyes of 126 patients with DME were enrolled to assess the anatomical (central retinal thickness, CRT, decrease ≥ 10% from baseline) and functional (best corrected visual acuity, BCVA, gain ≥ 5 ETDRS letters from baseline) prognostic value of baseline subfoveal choroidal thickness (SFCT) on anti-vascular endothelial growth factor (anti-VEGF), ranibizumab or aflibercept, treatment response after 3 (early outcome) and 6 months (late outcome). A comparison was made between SFCT and other choroidal thicknesses collected at different locations from the fovea to establish the value of SFCT as a surrogate of the choroidal thickness. In addition, 122 eyes of 122 patients were prospectively enrolled to search for anatomical (CRT) and functional (BCVA) baseline prognostic factors, other than SFCT, for recent onset DME under anti-VEGF agents’ treatment. Furthermore, two rat models of diabetes, streptozotocin (STZ)-induced Type 1 diabetes in Wistar rats (8 weeks-old; with further 8 weeks of diabetes duration) and Goto-Kakizaki (GK) Type 2 diabetes rats (1 year old) were used. In vivo choroidal thickness was evaluated in both models by optical coherence tomography (OCT). Vascular density of the choriocapillaris and middle/outer choroid was quantified in sclerochoroidal whole mounts of eyes perfused by 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). The immunoreactivity of vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-receptor 2 (VEGFR2), as well as the immunoreactivity of vimentin (marker of macroglial cells), Iba1 and MHC II (markers of non-activated and activated microglial cells/macrophages, respectively) and NG2 (marker of pericytes and perivascular mural cells), were assessed by immunohistochemistry, in the choroid and retina, in eye cryosections and in sclerochoroidal whole mounts. Images were acquired by fluorescence and confocal microscopy and the immunofluorescence was quantified by ImageJ. Moreover, Iba1, MHC II and NG2 positive cells were counted. Results: In diabetic patients, treatment of DME with anti-VEGF agents, ranibizumab and aflibercept, decreased the choroidal thickness. However, the SFCT was not a predictor of the anatomical or functional outcomes. SFCT was an excellent surrogate of the choroidal thickness, showing an excellent correlation with the other choroidal thickness parameters evaluated. The subretinal fluid was a predictor of the anatomical outcome, whereas the ellipsoid zone status and a good metabolic control were predictors of functional outcome, regardless of being early or late outcomes. In experimental models, significant differences between STZ (serious metabolic-imbalance) and GK (longer lasting diabetes and light metabolic-imbalance) rats were found. In vivo choroidal thickness increased in GK rats only and the choriocapillaris vascular density decreased in GK rats only, as well. Moreover, VEGFR2 immunoreactivity was upregulated in the retina of GK rats, being downregulated in the retina of STZ rats. The number of Iba1+ cells increased in the outer retina of both animal models. However, in the choroid, the number of Iba1+ cells and MHC II+ cells increased in STZ rats only. The aforementioned results for Iba1+ and MHC II+ cells indicate that the degree of such increase may depend on metabolic status and/or disease duration. Signs of pericyte depletion at the choriocapillaris were present in both models, being more evident in GK rats. Conclusions: Although there were alterations in the SFCT in DME under anti-VEGF treatment, the baseline SFCT was not a useful prognostic tool for DME. It was an indicator of time-dependent anti-VEGF’s subsiding effect on the choroid instead, and a good surrogate of the choroidal thickness as such. Good metabolic control and an intact ellipsoid zone were predictors of functional outcome while subfoveal neuroretinal detachment was a predictor of anatomic outcome only. The number of Iba1+ cells and MHC II+ cells increased in the choroid and retina in diabetic rats but the magnitude of such increase changed considerably when the metabolic status was seriously imbalanced. VEGFR2 immunoreactivity increased in the retina in longer diabetes duration and slighter metabolic imbalance. Conversely, VEGFR2 immunoreactivity decreased when there was a serious metabolic imbalance. Vascular remodelling or vascular depletion at the choriocapillaris was also a trait of the long lasting disease.
Introdução: Estudos recentes indicam que a espessura da coroide pode ser considerada fator de prognóstico na retinopatia diabética (RD) e no edema macular diabético (EMD), embora os resultados sejam contraditórios. A coroidopatia diabética e a natureza da RD, incluindo do EMD, têm características complexas, que incluem um componente inflamatório. Alterações na coroide, como a renovação vascular e a depleção capilar a nível da coriocapilar, e alterações na retina, tais como a ativação e migração de células da glia, foram descritas em ratos diabéticos. No entanto, o papel da espessura basal da coroide como fator de prognóstico no EMD não é consensual. Em modelos animais de diabetes, desconhece-se como varia a espessura da coroide e se existem alterações celulares e moleculares que ocorrem simultaneamente na coroide e na retina. Objetivos: Determinar o valor prognóstico da espessura basal da coroide e pesquisar outros fatores de prognóstico em doentes com EMD. Avaliar a espessura da coroide e alterações celulares e moleculares na coroide e na retina em modelos animais de diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D). Métodos: Cento e vinte e seis olhos de 126 doentes com EMD foram incluídos num estudo prospetivo, para avaliar o valor prognóstico da espessura coroideia subfoveal (ECSF) inicial, definido como anatómico (baixa da espessura basal central da retina ≥ 10%,) e como funcional (ganho na melhor acuidade visual corrigida, MAVC, basal ≥ 5 letras ETDRS), na resposta ao tratamento com ranibizumab ou aflibercept, ao final de 3 e 6 meses. Para determinar o valor da ECSF como indicador de espessura coroideia comparou-se a ECSF com espessuras da coroide à volta da fovea. Adicionalmente, 122 olhos de 122 doentes com EMD foram prospetivamente incluídos, para determinar outros fatores de prognóstico no EMD recente sob tratamento com anti-angiogénicos. Relativamente à diabetes experimental, utilizaram-se dois modelos de ratos diabéticos. Ratos Wistar em que foi induzida T1D através de uma injeção de estreptozotocina (STZ, às 8 semanas de idade, com mais 8 semanas de duração da diabetes) e ratos Goto-Kakizaki (GK) com um ano de idade, como modelo de T2D. A espessura da coroide foi avaliada in vivo por tomografia de coerência ótica (OCT) em ambos os modelos animais. A densidade vascular da coriocapilar e da coroide vascular, média e externa, foi quantificada em explantes esclero-coroideus de olhos perfundidos por perclorato de 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethilindocarbocianina (DiI). As imunorreatividades do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e do seu recetor 2 (VEGFR2), assim como a da vimentina (marcador das células da macroglia), de Iba1 e MHC II (marcadores da microglia/macrófagos não ativados e ativados, respetivamente), e de NG2 (marcador de pericitos e células murais peri-vasculares), foram determinadas por imuno-histoquímica na coroide e na retina, em criosecções e em explantes esclero-coroideus. As imagens foram adquiridas por microscopia de fluorescência ou confocal e a imunofluorescência foi quantificada pelo ImageJ. Procedeu-se também à contagem de células positivas para Iba1, MHC II e NG2. Resultados: A espessura coroideia subfoveal diminuiu com o tratamento do EMD, mas não revelou possuir valor prognóstico, quer anatómico quer funcional, precoce ou tardio. A ECSF revelou-se um bom marcador da espessura coroideia, possuindo uma boa correlação com os outros parâmetros de espessura coroideia. A existência basal de fluido sub-retiniano revelou-se fator de bom prognóstico anatómico, enquanto que uma zona elipsoide íntegra e um bom equilíbrio metabólico se revelaram fatores de bom prognóstico funcional, quer precoces quer tardios. Nos modelos experimentais, observaram-se diferenças significativas entre os ratos com diabetes induzida pela STZ (desequilíbrio metabólico acentuado) e os ratos GK (maior duração de diabetes com desequilíbrio metabólico ligeiro/moderado). Observou-se um aumento da espessura da coroide e uma diminuição da densidade vascular da coriocapilar, in vivo, apenas em ratos GK. A imunorreactividade para o VEGFR2 aumentou na retina dos ratos GK e diminuiu na retina dos ratos STZ. O número de células Iba1+ aumentou na retina externa em ambos os modelos animais, embora apenas nos ratos STZ se encontrasse aumentado no estroma da coroide. O número de células MHC II+ também aumentou apenas na coroide de ratos STZ. Estes resultados indicam que o incremento das células inflamatórias na coroide depende do estado metabólico e da duração da doença. Além disso, também se observaram sinais de rarefação de pericitos a nível da coriocapilar em ambos os modelos, embora essa alteração fosse mais evidente em ratos GK. Conclusões: Embora a ECSF diminua no EMD sob tratamento, não se revelou um fator de prognóstico para o EMD. Revelou-se apenas um indicador de duração de ação do anti-angiogénico e um bom índice de espessura coroideia em geral. Um bom controlo metabólico e uma zona elipsoide íntegra revelaram-se fatores de bom prognóstico funcional, enquanto que o fluido subretiniano se revelou fator de bom prognóstico anatómico. A espessura coroideia aumentou e a densidade vascular da coroide diminuiu apenas no modelo animal de T2D. O número de células Iba1+ e MHC II+ encontrava-se aumentado na coroide e na retina dos ratos T1D e T2D, mas esse aumento variou com o desequilíbrio metabólico e com a duração da doença. A imunorreactividade do VEGFR2 encontrava-se aumentada quando a duração da diabetes era mais prolongada e quando existia apenas um desequilíbrio metabólico ligeiro/moderado. Pelo contrário, a imunorreactividade do VEGFR2 revelou-se diminuída quando o desequilíbrio metabólico era acentuado. A rarefação e o aumento da renovação vasculares a nível da coriocapilar era uma característica que se acentuava numa situação de doença prolongada.
Description: Tese no âmbito do Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde – ramo de Medicina, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/92417
Rights: openAccess
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