Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/92173
Title: Computation meets experimentation to improve the catatysis and specificity of Cas12a genome editing enzyme
Other Titles: Aplicação de métodos computacionais e experimentais para melhorar a catálise e especificidade da enzima Cas12a para edição genética
Authors: Rajado, Ana Teresa Amado Mateus Santos
Orientador: Carvalho, Alexandra Teresa Pires
Pires, Paula Cristina Veríssimo
Keywords: CRISPR-Cas System; Edição genética; Cas12a; Biologia Computacional; Engenharia Racional de Proteínas; CRISPR-Cas System; Genome Editing; Cas12a; Computational Biology; Rational Protein Engineering
Issue Date: 10-Nov-2020
Serial title, monograph or event: Computation meets experimentation to improve the catatysis and specificity of Cas12a genome editing enzyme
Place of publication or event: UC-Biotech - CNC
Abstract: O sistema CRISPR-Cas é uma ferramenta aplicada a edição genética. Esta técnica tornou-se altamente relevante nos últimos anos devido ao seu baixo custo e facilidade de produção e utilização.Cas12a é uma endonuclease do tipo V do Sistema CRISPR-Cas, capaz de editar genoma humano recorrendo a um único RNA guia. Esta enzima já foi adaptada e utilizada em diversas áreas, tal como medicina e agricultura, através da edição genética de células de diferentes tipos, como por exemplo células animais e vegetais. No entanto, este sistema também enfrenta alguns problemas, dos quais se destacam as mutações introduzidas fora dos locais alvo (“off-target mutations”), que são introduzidas de forma não intencional.O objetivo deste trabalho é estudar o mecanismo catalítico da enzima Cas12a, com o intuito de aumentar a especificidade do mesmo. Com este propósito recorremos a uma combinação de métodos computacionais (Dinâmica Molecular) e experimentais (Biologia Molecular), para reduzir os efeitos “off-target” acima mencionados.Foram estudadas seis variantes da enzima nativa (direcionadas para as regiões da enzima que interagem com o motivo PAM, com o loop no terminal 5’ do crRNA e com o centro ativo da enzima) e dois estados intermediários do ciclo catalítico da mesma. Com as variantes criadas induzimos interações mais fortes do que as previamente presentes entre a FnCas12a, uma enzima para edição genética, e o crRNA e DNA alvo a ela associados. Substituímos resíduos polares e não polares por lisinas, carregadas positivamente, criando interações carga-carga com o DNA e o crRNA, o que poderá conduzir ao reconhecimento específico entre a proteína e os ácidos nucleicos através de um mecanismo de reconhecimento indireto (indirect readout mechanism), uma vez que os resíduos mutados não interagem com as bases azotadas.Explorámos também o mecanismo catalítico desta enzima, ao estudarmos a relevância dos resíduos H922 e R1218, localizados no local catalítico da enzima. De acordo com as nossas simulações, H922 aparenta ser o resíduo que atua como base catalítica através de um mecanismo concertado. Neste, a histidina deverá receber um protão da água enquanto que ao mesmo tempo esta realiza um ataque nucleofílico ao grupo fosfato em que irá ocorrer a clivagem.
The CRISPR-Cas system is a tool used for genome editing that became highly relevant in the latest years for being cheap, easy to design and produce.Cas12a is an endonuclease type V of the CRISPR-Cas system and is able to edit human genome through a single-RNA guided approach. This enzyme has already been repurposed to be applied in several fields, such as in medicine and agriculture, through the genome editing of different cells types such animal and plant cell. However a recurrent problem of these systems and related ones is the off-target mutations - unintentionally induced.The objective of this work is to study Cas12a enzyme. For this, we used a combination of computational (Molecular Dynamics) and experimental (Molecular Biology) methods, in order to surpass the above mentioned obstacles.Six variants of the wild type enzyme (directed to enzyme’ regions that interact with the PAM motif, the crRNA 5’ handle and with the active site of the protein) and two putative intermediates of its catalytic cycle were tested. With these variants, we induced stronger interactions between FnCas12a, a genome editing enzyme, and its crRNA and target DNA. We have substituted polar and non-polar residues with positively charged lysine residues creating new salt-bridges with the cRNA and DNA and possibly leading to specific recognition through an indirect readout mechanism, since the newly introduced residues do not interact with the bases.Additionally, we explored the catalytic mechanism of this enzyme, by studying the relevance of H922 and R1218, residues located in the catalytic site of the enzyme. According to our simulations, H922 seems to be the most probable residue to act as a base through a concerted mechanism, in which it receives a proton from the water, simultaneously with nucleophilic attack on the phosphate group that is going to be cleaved.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/92173
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:UC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat Login
Dissertação Corrigida AnaTeresa Amado Mateus Santos Rajado.pdf5.45 MBAdobe PDFEmbargo Access    Request a copy
Show full item record

Page view(s)

6
checked on Jan 14, 2021

Download(s)

2
checked on Jan 14, 2021

Google ScholarTM

Check


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons