Mitochondrial Impact in Innate Immunity Activation in Sporadic Parkinson's Disease

Abstract

A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa com uma etiologia fortemente associada com alterações metabólicas, nomeadamente com disfunção mitocondrial. A disfunção mitocondrial é considerada um dos eventos iniciais do processo neurodegenerativo na DP esporádica. Em condições normais, mitocôndrias disfuncionais são degradadas através da mitofagia, no entanto na DP esta via parece estar também comprometida, impedindo a remoção destes organelos disfuncionais. Uma rede mitocondrial fragmentada permite a exposição de padrões moleculares associados a danos (DAMPS), o que leva a uma ativação da imunidade inata. Neste estudo abordámos o “crosstalk” entre a disfunção mitocondrial e a ativação da imunidade inata em células citoplasmáticas híbridas (cíbridos), derivadas de teratocarcinoma humano (NT2) que contêm ADN mitocondrial de doentes com DP ou de indivíduos controlo. Para este propósito expusemos os cíbridos de controlo e de DP a lipolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas e/ou a leupeptina e cloreto de amónia, um par de compostos que bloqueia a autofagia, e consequentemente a mitofagia. O objetivo foi mostrar que a disfunção mitocondrial pode regular respostas da imunidade inata no contexto de DP. A este respeito, foi observado que cíbridos de DP têm o potencial membranar mitocondrial diminuído, o que se correlaciona com uma rede mitocondrial fragmentada que foi visualizada por microscopia, e a um aumento dos níveis de DRP1 fosforilada. Uma rede mitocondrial fragmentada expõe cardiolipin que funciona como um DAMP ativando a imunidade inata. Observámos que cíbridos de DP têm níveis basais de TLR3, NLRP3 e a sua proteína adaptadora ASC aumentados. No entanto, verificamos que o LPS e a leupeptina e o cloreto de amónia conseguem aumentar as respostas imunes. Resultados similares foram obtidos para a ativação da caspase 1, que está aumentada em condições basais nos cíbridos DP e que aumentou com ambos os tratamentos. Verificamos que os cíbridos de DP também têm um fluxo autofágico de LC3 basal e de p62 comprometido, o que demonstra que a mitofagia também está comprometida. A acumulação de mitocôndrias disfuncionais aumenta as respostas da imunidade inata em cíbridos DP aumentando ainda mais a ativação do inflamossoma NLPR3. Finalmente, investigámos a oligomerização de α-sinucleína (α-sin) nas condições descritas. Detetámos que os cíbridos de DP têm uma acumulação de oligómeros de α-sin basal e que apena o tratamento com leupeptina e cloreto de amónia aumenta a sua acumulação. Em conclusão, nós provamos a disfunção mitocondrial está na base da ativação da imunidade inata em DP.

Parkinson Disease (PD) is a neurodegenerative disorder which etiology has been strongly associated with metabolic abnormalities namely mitochondrial dysfunction. Since mitochondria control a wide range of cellular processes the up-stream position of this organelle in the cascade of events leading to neurodegeneration in PD has been recognized. In healthy conditions, dysfunctional mitochondria are degraded through mitophagy however in PD mitochondrial degradation is impaired, preventing the clearance of these dysfunctional organelles. Without this clearance innate immunity responses will be activated, through the exposition of damage associated molecular patterns (DAMPs). In this study we addressed the crosstalk between mitochondrial dysfunction and the activation of innate immunity pathways, through the use of cytoplasmatic hybrids (cybrid) cells, derived from NT2 teratocarcinoma, repopulated with mitochondrial DNA from PD patients or age-matched control subjects. For this purpose, we exposed PD and control cybrids to lipopolysaccharide (LPS) from gram negative bacteria and/or to leupeptin plus ammonium chloride (NH4Cl), a pair of compounds that blocks autophagy, and consequently, mitophagy. The goal was to provide evidence that mitochondrial dysfunction can regulate innate immune responses in a context of PD. In this regard, observed that PD cybrids have decreased mitochondrial membrane potential which correlates with a fragmented mitochondrial network visualized by microscopy and the increased levels of phosphorylated DRP1. Fragmented mitochondrial network exposes cardiolipin that functions as a DAMP activating innate immunity responses. We observed that PD cybrids have basal increased levels of TLR3, NLRP3 and its adaptor protein ASC and can further increment immune responses when exposed to LPS and leupeptin plus ammonium chloride. Similar results were obtained for caspase 1 activity, which is increased in PD cybrids in basal conditions and increase with both treatments. PD cybrids also have basal impaired LC3 autophagic flux and p62 flux, which is specific for mitophagy. This accumulation of dysfunctional mitochondria upholds innate immunity responses in PD cybrids further increasing NLRP3 inflammasome activity. Finally, we investigated the oligomerization of α-synuclein (α-syn) in the described conditions. We detected that PD cybrids have basal accumulation of α-syn oligomers and only leupeptin and ammonium chloride treatment further increases its accumulation. In conclusion we prove that mitochondria are at the base of innate immunity activation in PD.