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Title: Targeting Nucleolin in Lung Cancer: towards a personalized therapy
Authors: Fernandes, Ângela Filipa Valério 
Orientador: Moreira, João Nuno
Simões, Sérgio
Keywords: Lung cancer; Tumor microenvironment; Nanomedicine; Nucleolin; Targeting
Issue Date: 19-Jul-2016
Abstract: Cancer is a major worldwide public health problem, accounting for about 12% of all causes of death worldwide. Lung cancer is the leading cause of cancer-related mortality both in men and women, with over 1.5 million deaths each year and approximately 2 million of new cases are diagnosed each year throughout the world. From these, over 1 million patients are diagnosed with non-small cell lung cancer (NSCLC) each year. Most of these patients present with locally advanced inoperable or metastatic disease, which makes their cancer incurable, and unfortunately almost all of these patients will die from this disease. Notwithstanding the multiple advances in the staging, diagnostic procedures and therapeutic options in recent decades, the overall outcome for patients with advanced NSCLC remains insufficient, with a median survival time of 12 months. The development of novel and effective therapies is thus urgently needed. Research in the field of tumor angiogenesis has provided the foundation for a radical change in the management and treatment of human cancer, including NSCLC. Anti-angiogenic approaches have been studied in the clinic, but thus far only drugs that target the vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor pathway have been validated based on phase III clinical trials to provide clinical benefit. Despite these important advances, it is well recognized that many patients do not respond to VEGF-targeted therapy, and for those that do, responses are short-lived, and resistance develops in the majority of patients. Drug resistance remains a major challenge for oncologists treating patients with advanced or metastatic disease. Thus, more research is needed to develop strategies that overcome these therapeutic problems. A therapy based on vascular tumor targeting of chemotherapeutic agents, can potentially overcome several problems in cancer treatment, such as drug resistance of tumor cells or insufficient drug penetration into the interior of a tumor mass because of high interstitial pressure gradients within tumors. Ideal therapeutic targets are those that are specifically expressed in cancer cells and are critical for maintaining malignancy. Approaches to understanding cancer biology have changed considerably over time enabling the discovery of several new molecular targets. Much effort has been geared toward developing drugs that target cancer-specific molecules so as to minimize damage to normal tissues. These strategies also aims to create drugs that are useful in a wide variety of cancers rather than those located in a particular tissue. The process for designing anti-cancer strategies also leads to promising advancements in developing personalized therapy which is based on a better understanding of the disease at the molecular level, and nanotechnology plays an important role in this area. An enormous therapeutic impact has been achieved using F3-targeted sterically-stabilized pH-sensitive liposomes containing doxorubicin that targeting the nucleolin receptor overexpressed on the surface of two different populations within the tumor microenvironment (tumor and endothelial cells). The combination of tumor and vascular targeting with intracellular triggered release of the encapsulated drug was crucial for the successful therapeutic outcome of a nanotherapeutic strategy against a solid tumor. This nanoparticle was able to combine stability in the blood stream, increased retention of the encapsulated drug and dual targeting to a solid tumor, with proven therapeutic efficiency. Based on these developments, potential benefits are expected in the clinic. A promising challenge is to investigate, in the preclinical setting, the potential impact of the new developed nucleolin-targeted nanoparticle in lung cancer. In this project it is proposed to investigate the antitumor impact of targeting the tumor microenvironment of resistant NSCLC models using this strategy. In this respect, we first aim at validating nucleolin as a therapeutic target for F3 peptide-targeted liposomes containing a chemotherapeutic drug (doxorubicin), in NSCLC cell models. Results demonstrated binding and internalization of the F3-targeted liposomes by lung cancer cells, suggesting a ligand-specific interaction, in an extent of association that was 35 to 170-fold higher than the one observed with the tested controls. Improved association and intracellular delivery of the encapsulated doxorubicin enabled by F3-targeted liposomes, justified a maximum of 19-fold increase of doxorubicin cytotoxicity relative to the activity of doxorubicin delivered by control liposomes. Furthermore, through an ex vivo autoradiography study with patient-derived NSCLC tumors, we demonstrated an extensive binding of the radiolabeled F3-targeted nanoparticle by human tissue, in contrast with the non-targeted counterpart which shown no accumulation in human tumors. Additionally, immunohistochemical studies in human NSCLC specimens revealed that nucleolin was highly expressed in several cell populations in the tumor microenvironment of patient-derived lung tumors, in a tumor-specific manner. Thus, we hypothesized that such nanotherapeutic strategy could achieve a significant antitumor effect in lung cancer patients overexpressing nucleolin. Accordingly, as our main goal is translating this strategy to clinic in an attempt to personalize therapy in lung cancer patients, we next propose to investigate and characterize the subcellular expression of nucleolin in the tumor microenvironment of NSCLC patient-derived specimens. In addition, and correlating with nucleolin expression, we also analyzed the expression of several angiogenic regulators (VEGFR2, PDGFRα, FGFR2, HIF1α, IL-17) and CD133, a lung cancer stem cell marker also involved as an angiogenic regulator in NSCLC, described as implicated in some mechanisms of resistance to anti-angiogenic therapies. Data demonstrated nuclear expression of nucleolin in all patients analyzed, independently of the clinicopathological features. Of these, we were able to distinguish extra-nuclear expression in 36% patients. Moreover, within the tumor microenvironment we were able to identify nucleolin expression not only in cancer cells themselves, but again in many different cell populations in tumor stroma, including endothelial cells of 92% of all patients, which is consistent with its angiogenic role. Meanwhile, we found no correlation of extra-nuclear expression in stromal endothelial cells and any other angiogenic factor analyzed or, even with, any clinicopathological feature. These data suggests that extra-nuclear nucleolin could be an independent angiogenic marker in these patients, since independently of other angiogenic factors expression and, moreover, also independent of the clinical status (including histologic subtype) of NSCLC patients, nucleolin is expressed in stromal endothelial cells of these patients. Currently in clinic, treatments available could not display efficacy against metastatic tumors and it is known that close to 70% of patients with lung cancer present locally advanced or metastatic disease at the time of diagnosis. Thus, to reveals the importance of nucleolin in different stages of lung cancer we investigated the expression on nucleolin in bone metastasis from lung cancer patients, and also from others primary origins. We demonstrated through immunohistochemical analysis that nucleolin in overexpressed in the tumor microenvironment of all metastatic patients in study with similar pattern of primary tumor expression. These data supports the use of a nucleolin-specific targeted strategy against metastasis besides the primary tumor, providing the access to metastasis microenvironment. Overall, results presented here highlights the unique features of F3-peptide targeted liposomes and potential value as therapy also in lung cancer. Data strongly suggests that specific targeting of nucleolin as a therapeutic strategy could significantly increase the efficacy of treatment by multi-targeting the tumor microenvironment (cancer, endothelial cells of the tumor vasculature and even other tumor stromal cells) in NSCLC patients. Consequently, these achievements represent a significant step towards the main goal of personalizing therapy in lung cancer.
O cancro é o maior problema de saúde pública a nível mundial, sendo responsável por cerca de 12% de todas as causas de morte. O cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada com o cancro, tanto em homens como em mulheres, com mais de 1.5 milhões de mortes por ano e cerca de 2 milhões de novos casos diagnosticados anualmente em todo o mundo. Destes, mais de 1 milhão é diagnosticado com cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC) e a grande maioria irá morrer devido a esta doença. Apesar de relevantes avanços nas últimas décadas, o resultado da terapia para doentes com CPNPC permanece insuficiente, com um tempo de sobrevivência médio de cerca de 12 meses. O desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que se revelem mais efetivas, é inquestionavelmente urgente. Investigação na área da angiogénese tumoral tem fornecido as bases para uma mudança radical na gestão e tratamento do cancro humano. Têm sido estudadas diversas abordagens terapêuticas anti-angiogénicas na clínica, mas, até agora, somente medicamentos que visam inibir a via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), e seus recetores (VEGFR), têm sido aprovados pela FDA. Em ensaios clínicos na fase III, estes agentes terapêuticos demonstraram benefício clínico em doentes com diversos tipos de cancro, incluindo o CPNPC. No entanto, apesar dos enormes avanços alcançados, muitos doentes não respondem à terapia dirigida ao VEGF, e para aqueles que o fazem, as respostas são de curta duração e a maioria desenvolve resistência à terapia. Resistência à terapia continua a ser um dos maiores desafios para os oncologistas, mesmo com estas novas abordagens terapêuticas. Desta forma, é necessária mais investigação para se desenvolverem estratégias que superem estes problemas na clínica. Terapia baseada no direcionamento específico de agentes quimioterapêuticos para a vasculatura do tumor pode, potencialmente, superar diversos problemas no tratamento do cancro, tais como, a resistência das células tumorais aos agentes terapêuticos ou penetração insuficiente de fármacos no interior da massa tumoral devido aos elevados gradientes de pressão intersticial nos tumores. Alvos terapêuticos ideais são expressos especificamente pelas células tumorais e têm uma função essencial na doença. Ao longo do tempo, as estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento oncológico têm evoluído imensamente. A maioria dos avanços da terapia do cancro têm sido no sentido aumentar a especificidade do tratamento para as células tumorais, enquanto se diminui a agressão aos tecidos normais. Estas estratégias têm também como objetivo alargar o espectro de aplicabilidade a diferentes tipos de cancro, sendo desenvolvidas especificamente contra alvos que são comuns à maioria dos tumores e não associados a um tipo de tecido. O desenvolvimento de terapias especificamente dirigidas a alvos terapêuticos tumorais tem também possibilitado importantes avanços no sentido de personalizar as terapias do cancro, que deriva do conhecimento da doença ao nível molecular. A nanotecnologia tem um papel fundamental nesta área. Recentemente, foi desenvolvida uma nova estratégia terapêutica baseada numa nanopartícula peguilada de base lipídica, sensível ao pH e encapsulando doxorrubicina, que revelou ter um significante impacto terapêutico contra um tumor sólido. Esta plataforma nanotecnológica é direcionada com o peptídeo F3 e especificamente dirigida ao recetor da nucleolina sobre-expresso na superfície de duas populações celulares distintas no microambiente tumoral (células cancerígenas e células endoteliais tumorais). Esta nanopartícula combina estabilidade na corrente sanguínea, aumento da retenção do fármaco encapsulado e duplo direcionamento específico a um tumor sólido, com eficácia terapêutica comprovada. O duplo direcionamento aliado à libertação do fármaco encapsulado no compartimento intracelular revelou ser crucial para o sucesso terapêutico desta recente estratégia terapêutica. Com base nestes desenvolvimentos, são esperados benefícios significativos na clínica. Um desafio promissor é investigar, no contexto pré-clínico, o potencial anti-tumoral desta abordagem nanoterapêutica em cancro do pulmão, superando o problema de resistência associados a novas terapias e aumentando as possibilidades terapêuticas. Nesta perspetiva, é proposto investigar o impacto terapêutico da terapia dirigida ao microambiente tumoral, em modelos de CPNPC com resistência à terapia anti-angiogénica, usando esta nova estratégia terapêutica. Os resultados in vitro, demonstraram uma ligação e internalização eficazes da nanopartícula, especificamente dirigida para a nucleolina, pelas células humanas de CPNPC, sugerindo uma interação específica promovida pelo ligando F3, numa extensão que se revelou 35 a 170 vezes superior à observada com as nanopartículas controlo. O aumento da associação celular e consequente libertação intracelular da doxorrubicina, encapsulada na nanopartícula, justifica os efeitos citotóxicos da droga especificamente libertada por esta nanopartícula, que se revelaram até 19 vezes superiores aos efeitos provocados pela doxorrubicina libertada por nanopartículas controlo não dirigidas ou, dirigidas inespecificamente. Para além disso, através de estudos ex vivo de autoradiografia em tumores de doentes com CPNPC, demonstramos uma enorme extensão de ligação da nanopartícula dirigida pelo peptídeo F3 ao tecido tumoral humano, contrariamente ao observado com a nanopartícula controlo não dirigida. Adicionalmente, estudos de imunohistoquímica em amostras de doentes de CPNPC revelaram que a nucleolina está sobre-expressa em diferentes populações do microambiente tumoral de forma específica. Assim, colocamos a hipótese de que esta nova estratégia nanoterapêutica poderá vir a ter um enorme potencial anti-tumoral em doentes de cancro de pulmão que sobre-expressem a nucleolina. Neste sentido e, sendo o nosso principal objetivo validar uma nova estratégia terapêutica com elevado potencial clinico e, que possibilite personalizar a terapia em cancro do pulmão, de seguida procedemos à caracterização da expressão sub-celular da nucleolina no microambiente tumoral de doentes de cancro de pulmão de não pequenas células. Adicionalmente e, tendo em consideração a função angiogénica da nucleolina em diferentes tipos de cancro, fomos também investigar a relação da nucleolina com diversos outros fatores angiogénicos (VEGFR2, PDGFRα, FGFR2, HIF1α, IL-17) e, também, o marcador estaminal de cancro do pulmão (CD133), sendo descritos como estando envolvidos no desenvolvimento de mecanismos de resistência a terapias anti-angiogénicas. Os resultados revelaram expressão nuclear da nucleolina em todas as amostras humanas analisadas, independentemente das suas características clinico-patológicas. Nestes doentes conseguimos também distinguir expressão extra-nuclear da nucleolina. Além disso, identificamos expressão da nucleolina não só nas células cancerígenas propriamente ditas mas, mais uma vez, também em diferentes populações do estroma no microambiente tumoral, incluindo células endoteliais em 92% dos doentes, consistente com a função angiogénica da nucleolina. No entanto, neste estudo não detetamos qualquer relação da expressão da nucleolina extra-nuclear com nenhum dos outros fatores angiogénicos, nem mesmo com as características clinico-patológicas. Estes resultados sugerem que a nucleolin extra-nuclear pode ser um marcador angiogénico independente em CPNPC, uma vez que independentemente do estado clinico ou, mesmo de outros fatores angiogénicos, a nucleolina é expressa nas células endoteliais dos vasos tumorais nestes doentes. Atualmente na clínica, as terapias disponíveis muitas vezes não demonstram eficácia em tumores metastáticos e, em cancro do pulmão, aproximadamente 70% dos doentes diagnosticados apresentam doença avançada ou metastática. Desta forma, fomos investigar a importância da nucleolina como potencial alvo terapêutico em amostras de doentes com metástases ósseas. Por análise imunohistoquímica, demonstramos que a nucleolina estava sobre-expressa em todas as amostras em estudo, com um padrão de distribuição de expressão semelhante ao encontrado nos tumores primários. Estes resultados são uma primeira indicação de que a nucleolina poderá ser um alvo terapêutico ideal não só em tumores primários, mas também em metástases, possibilitando o acesso também ao microambiente metastático. Globalmente, os resultados aqui apresentados enaltecem as características únicas de uma nova estratégia nanoterapêutica direcionada especificamente para a nucleolina. O direcionamento específico para a nucleolina como alvo terapêutico em cancro do pulmão, poderá aumentar significativamente a eficácia desta abordagem terapêutica, enquanto diminui problemas atualmente descritos na clinica, como o desenvolvimento de resistência, através da possibilidade de multi-direcionamento da terapia para o microambiente tumoral (células cancerígenas, endoteliais e, até para outras células do estroma tumoral) em cancro do pulmão de não pequenas células. Por último, a estratégia aqui descrita poderá representar um avanço no sentido da personalização da terapia em cancro do pulmão.
Description: Thesis submitted to the Institute for Interdisciplinary Research of the University of Coimbra to apply for the degree of Doctor in Philosophy in the area of Experimental Biology and Biomedicine, specialization in Oncobiology.
Rights: openAccess
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