Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/89828
Title: Dissecting the role of specific microRNAs on effector and regulatory CD4+ T cells subsets differentiation in vitro
Other Titles: Caracterização da função de miRNAs na diferenciação in vitro de populações efetoras e reguladoras de linfócitos T CD4+
Authors: Costa, Catarina Pelicano da Cunha Branco da
Orientador: Silva-Santos, Bruno
Rosa, Manuel Amaro de Matos Santos
Keywords: miRNAs; CD4+ T cell differentiation; effector T cell; regulatory T cell; posttranscriptional regulation; miRNAs; diferenciação de linfócitos T CD4+; célula T efetora; célula T reguladora,; regulação pós-transcricional
Issue Date: 20-Sep-2019
Project: info:eu-repo/grantAgreement/EC/H2020/646701/EU 
Serial title, monograph or event: Dissecting the role of specific microRNAs on effector and regulatory CD4+ T cells subsets differentiation in vitro
Place of publication or event: Instituto de Medicina Molecular
Abstract: CD4+ T cells orchestrate immune responses to several microorganisms and tumours, help B cells in antibody production, maintain CD8+ T cells’ cytotoxicity and suppress inflammation. Upon TCR activation, CD4+ T cells differentiate into functionally distinct T cell subsets with different gene and cytokine expression profiles, that include the pro-inflammatory effector T helper (Th) 1 and Th17 cells, and the anti-inflammatory regulatory T (Treg) cells. An adequate balance between effector and regulatory T cells is crucial for the immunological homeostasis. microRNAs have been demonstrated to regulate gene expression networks, which affects the differentiation or maintenance of Th populations and ultimately impacts the balance between them. Although several specific miRNAs have been implicated in in vitro CD4+ T cell differentiation, in this thesis we aimed at further dissecting the miRNA regulation of Teff/Treg balance, based in an in vivo holistic approach. Treg, Th1 and Th17 cell populations were isolated from the spleen and lymph nodes of a triple reporter IL-17-GFP:IFN-γ-YFP:Foxp3-hCD2 mouse strain upon EAE induction. The miRNA expression profile of each population was analysed by miRNA-seq and 10 miRNAs were found to be differentially expressed between the 3 subsets. Upon differentiation of naïve CD4+ T cells into Th1, Th17 and Treg cells in vitro, the candidate miRNA expression patterns were validated by RT-qPCR. Gain-of-function studies were performed with retroviral transduction of miR-125a, miR-467a, miR-7667 or miR-126a into in vitro-differentiated T cell subsets and expression of Foxp3, IFN-γ and IL-17 was analysed. Our data showed that candidate miRNA overexpression had no impact on cell viability or proliferation. We found that despite miR-7667 being upregulated in Th1 cells relative to other subsets, its overexpression decreases the frequency of IFN-γ-producing Th1 cells. Following the same profile, overexpression of miR-126a hinders Th17 polarization as indicated by the decrease in IL-17+ cells. Overall, our data suggest that miR-7667 and miR-126a could play a role in controlling inflammatory responses by Th1 and Th17 cells, respectively and emphasize the importance of epigenetics in the control of immune responses. Further confirmation of physiological relevance of these miRNAs is confirmed and their target identification will highlight the relevance of these miRNAs for the balance of Teffector and Treg cells and ultimately contribute to the development or improvement of immune therapies for autoimmune diseases or cancer.
Os linfócitos T CD4+ são responsáveis por orquestrar a defesa imunológica contra diversos patógenios, auxiliar na produção de anticorpos pelos linfócitos B e manter a função dos linfócitos T CD8+. As células T circulam pelo organismo e é através da interação do TCR com as células apresentadoras de antigénios que identificam microrganismos patogénicos e são ativadas. Os linfócitos T CD4+, também designados por linfócitos T auxiliares (T helper ou Th em inglês), podem diferenciar-se em diversos subtipos celulares funcionalmente diferentes. As células Th1, estimuladas na presença de IL-12, expressam o fator de transcrição T-bet, produzem grandes quantidades de IFN-γ e são necessárias para uma resposta eficiente contra infeções intracelulares e tumores. Os linfócitos Th17, caracterizados pela produção de IL-17 e pela expressão de RORγt, são induzidos na presença de TGF-β, IL-23, IL-21 e IL-6 e intervêm na defesa contra bactérias extracelulares e fungos. Os linfócitos T reguladores surgem na presença de IL-2 e TGF-β e caracterizam-se pela expressão de Foxp3 e elevados níveis de CD25. Estas células detêm a importante função de suprimir respostas pro-inflamatórias, promovendo a homeostase e tolerância imunológica. Uma disfunção dos linfócitos T reguladores ou a excessiva ativação das populações T efetoras leva a que o organismo seja incapaz de controlar a inflamação, podendo originar doenças autoimunes, em que se gera uma resposta imunológica contra o próprio organismo. Por outro lado, caso as células T efetoras não sejam capazes de gerar uma resposta imunológica eficaz, o organismo não conseguirá defender-se, o que resulta numa maior suscetibilidade a infeções oportunistas e certos tipos de tumor. É, assim, essencial que o balanço entre populações efetoras e reguladoras seja o adequado a cada situação. Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificante capazes de silenciar a expressão de genes-alvo, através da desestabilização ou da inibição da transcrição dos respetivos RNA mensageiros. É cada vez mais evidente a contribuição dos miRNAs para processos celulares fundamentais, tais como a diferenciação de linfócitos T. Ainda que já se conheçam vários miRNAs específicos envolvidos na diferenciação de linfócitos T CD4+ in vitro, o papel fisiológico de muitos desses miRNAs permanece ainda por apurar. O objetivo deste trabalho consistiu em dissecar o papel individual de certos miRNAs na regulação do balanço entre populações de linfócitos T CD4+ efetoras e reguladoras. Para tal, desenvolvemos o nosso trabalho com base numa estratégia holística baseada em dados fisiologicamente relevantes in vivo. Isolámos populações de células Treg, Th1 e Th17 do baço e nódulos linfáticos de uma estirpe de murganho repórter tripla para IFN-γ (YFP), IL-17A (GFP) e Foxp3 (hCD2) na qual induzimos encefalomielite autoimune experimental (EAE). Os respetivos repertórios de miRNAs foram analisados por sequenciação de nova geração especialmente desenhada para pequenas moléculas de RNA, tendo-se identificado 10 miRNAs diferencialmente expressos entre as 3 populações analisadas. Seguidamente, a expressão destes miRNAs foi analisada por RT-qPCR em células Treg, Th1 e Th17 diferenciadas in vitro a partir de células T CD4+ naïve de murganho. Dos 10 miRNAs identificados in vivo, 5 tinham o mesmo perfil de expressão in vitro: o miR-125a, o miR-15b e o miR-467a, sobre-expressos em células Treg; o miR-7667, sobre-expresso em Th1 e o miR-126a, sobre-expresso em Th17. De forma a modular a função dos miRNAs que reproduziram os dados de sequenciação, clonámos o miR-125a, o miR-467a, o miR-7667 e o miR-126a em partículas retrovirais com que transduzimos as células Treg, Th1 e Th17 diferenciadas in vitro. Para estudar o efeito destes miRNAs na viabilidade e proliferação celular, utilizámos um corante Live/Dead que permite identificar células mortas e avaliámos os níveis de Ki-67, respetivamente. Observámos que a viabilidade das três populações celulares se mantinha e que os níveis de proliferação de Treg e Th1 permaneciam inalterados aquando a incubação com qualquer um dos miRNAs. Para estudar o efeito dos miRNAs no fenótipo de cada uma das populações, analisámos o nível de expressão de Foxp3, IFN-γ e IL-17. O miR-125a e o miR-467a não provocaram qualquer efeito nas populações de interesse. Embora a sobre-expressão do miR-7667 não tenha tido impacto nas células Treg ou Th17, observámos que diminuía a frequência de células IFN-γ+ da população Th1. Da mesma forma, a sobre-expressão do miR-126a apenas interferiu com a diferenciação das células Th17, levando a uma diminuição na frequência de células IL-17+. Globalmente, os nossos resultados sugerem que o miR-7667 e o miR-126a poderão ter um papel importante no controlo de respostas pro-inflamatórias mediadas, respetivamente, por células Th1 e Th17 e enfatizam a importância da epigenética na modulação da resposta imune, podendo ser úteis no desenvolvimento ou melhoria de terapias imunes.
Description: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
URI: http://hdl.handle.net/10316/89828
Rights: embargoedAccess
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