Mecanismos de Interação de Fármacos e Proteínas com DNA Detetados In Situ com o Biossensor Eletroquímico Modificado com Nanoestruturas de DNA

Abstract

O biossensor eletroquímico de DNA consiste num dispositivo em que o DNA é imobilizado na superfície de um transdutor eletroquímico, para detetar processos específicos de ligação com diferentes moléculas, monitorar as mudanças na estrutura conformacional do DNA após a interação com essas moléculas, e o aparecimento de resíduos das bases do DNA e dos seus produtos de oxidação, os biomarcadores do dano oxidativo do DNA. A interação entre o fármaco antiacne isotretinoína, o antibiótico daptomicina, o antileishmanial miltefosina, o antidiabético metformina, e o anticorpo monoclonal anticancro nivolumab com dsDNA foi investigada. Ademais, as interações do DNA bacterial da Xylella fastidiosa com o potencial agente pesticida Cu(II), bem como o DNA do timo de vitela e Cu(II) foram avaliadas. Inicialmente, o comportamento eletroquímico dos fármacos e proteína utilizados durante as interações com DNA foram investigados por meio de métodos eletroquímicos. As interações com DNA foram então avaliadas em soluções incubadas por voltametria de impulso diferencial, espectrofotometria no UV-Visível e/ou eletroforese em gel, e com biossensores eletroquímicos de dsDNA, poly[G] e poly[A], preparados na superfície dos elétrodos de diamante dopado com boro e carbono vítreo, por voltametria de impulso diferencial, espectroscopia de impedância eletroquímica e/ou microbalança de cristal de quartzo. Os métodos eletroquímicos mostraram-se eficientes tanto na investigação dos mecanismos de transferência de eletrões nos fármacos e proteína, como na interação destes com o DNA e com os biossensores eletroquímicos de dsDNA. Mudanças na conformação estrutural do dsDNA relacionadas com a condensação e/ou agregação, distorção e/ou abertura da dupla hélice, ligação das moléculas nos sulcos do DNA, libertação de resíduos de guanina e adenina, foram observadas e os mecanismos de interação foram propostos. Nas condições experimentais utilizadas todas as interações dos diferentes fármacos-dsDNA não foram eletroquimicamente detetados danos oxidativos na estrutura basal do DNA. Os biossensores eletroquímicos de DNA utilizados neste trabalho apresentam-se como uma metodologia de investigação rápida, in situ e em tempo real dos efeitos de diversas fontes de dano sobre o material genómico. Os estudos reportados poderão contribuir para uma melhor compreensão dos processos de interação que ocorrem in vivo, possibilitar o desenvolvimento de novas moléculas com potencial farmacológico e impulsionar o desenvolvimento de novos dipositivos voltados para a indústria, área da saúde, agricultura, baseados na deteção eletroquímica do DNA.

A DNA-electrochemical biosensor consists of a device in which the DNA is immobilized on the electrochemical transducer surface to detect specific binding processes with different molecules, to monitor changes in the DNA conformational structure after interaction with these molecules, and the appearance of DNA base residues and their oxidation products, the biomarkers of oxidative DNA damage. The interaction between the drugs, the antiacne isotretinoin, the antibiotic daptomycin, the antileishmanial miltefosine, the antidiabetic metformin, and the anticancer monoclonal antibody nivolumab with dsDNA was investigated. In addition, the interactions of the bacterial DNA from Xylella fastidiosa with the potential pesticidal agent Cu(II), as well as the calf thymus DNA and Cu(II) were evaluated. Initially, the electrochemical behaviour of the drugs and protein used during the DNA interactions were investigated using electrochemical methods. The interactions with DNA were then evaluated in incubated solutions by differential pulse voltammetry, UV-Visible spectrophotometry and/or gel electrophoresis, and with dsDNA-, poly[G]- and poly[A]-electrochemical biosensors, prepared on the boron-doped diamond and glassy carbon electrode surface, by differential pulse voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy and/or quartz crystal microbalance. Electrochemical methods proved to be efficient in the investigation of electron transfer mechanisms in drugs and protein, as well as in the interaction of these with dsDNA in incubated solutions and using dsDNA-electrochemical biosensors. Changes in the dsDNA structural conformation related to the condensation and/or aggregation, distortion and/or unwinding of the double helix, binding of the molecules in the DNA grooves, release of guanine and adenine residues were observed, and the interaction mechanisms were proposed. In the experimental conditions used during the different molecules-dsDNA and protein-dsDNA interactions oxidative damages in the DNA basal structure were not electrochemically detected. The DNA-electrochemical biosensors used in this work are presented as a methodology for rapid, in situ and real-time investigation of the effects of several sources of damage on the genomic material. The reported studies may contribute to a better understanding of the interaction processes occurring in vivo, to enable the development of new molecules with pharmacological potential and to promote the development of new devices aimed at industry, health and agriculture, based on the DNA electrochemical detection.