Evaluation of the immunotoxicological properties of PLA nanoparticles

Abstract

O ácido polilático (PLA) é um polímero biodegradável e biocompatível aprovado pela FDA derivado de recursos renováveis, o qual tem sido amplamente utilizado como um promissor sistema de entrega nanoparticulado. No entanto, quando usado como nanopartícula polimérica (NP), os seus efeitos imunotoxicológicos não se encontram bem documentados. Assim sendo, este estudo pretende avaliar a toxicidade de duas NPs de PLA com tamanhos diferentes (PLAA NPs e PLAB NPs) após uma extensa caracterização físico-química em condições experimentais in vitro. Adicionalmente, outras duas NPs poliméricas foram produzidas e usadas como termos de comparação: as NPs de policaprolactona (PCL) e as NPs de PCL/quitosano (PCL/CHI).Após produção, o diâmetro médio das NPs de PLAA (187,9 nm ± 36,9 nm) foi superior às NPs de PLAB (109,1 nm ± 10,4 nm). Em relação às outras NPs poliméricas, as NPs de PCL/CHI apresentaram um diâmetro médio (266,1 nm ± 63,8 nm) superior às NPs de PCL (170,0 nm ± 15,2 nm) e um potencial zeta positivo distinto das outras NPs, confirmando desta forma a presença de CHI na estrutura da NP. No entanto, quando dispersas em meio de cultura celular, todas as NPs apresentaram um perfil diferente, o que poderá explicar os resultados dos ensaios realizados.Por exemplo, contrariamente ao que foi observado anteriormente em água apirogénica, em meio DMEM, as NPs de PLAA apresentaram um diâmetro médio menor quando comparado com o tamanho das NPs de PLAB, o que pode explicar a respetiva maior toxicidade observada em RAW 264.7, apresentando um IC50 estimado de 540,6 μg/mL. O mesmo aconteceu com as NPs de PCL/CHI, as quais também apresentaram um decréscimo no tamanho em meio DMEM e foram as que apresentaram maior toxicidade, com um IC50 estimado de 68,89 μg/mL. Da mesma forma, as NPs de PLAA e PCL/CHI induziram os níveis dependentes da concentração usada mais elevados de produção de espécies reativas de oxigénio (ROS).Independentemente das diferenças de tamanho, nenhuma das NPs poliméricas deste estudo apresentou um potencial inflamatório (produção de NO) em RAW 264,7, nem toxicidade em PBMCs ou ainda atividade hemolítica em sangue humano.Relativamente à produção de citocinas (TNF-α and IL-6), a presença de CHI na estrutura das NPs de PCL/CHI pareceu exacerbar a produção de citocinas quando comparadas às NPs de PCL mas ambas levaram a um aumento maior de produção de citocinas quando comparadas com as NPs de PLA. No entanto, apesar de terem sido usados sangues de 6 dadores diferentes, estes resultados deveriam ser repetidos com mais dadores devido à variabilidade entre indivíduos. Ademais, apesar das NPs serem produzidas em condições livres de endotoxinas, este estudo poderia ser repetido na presença de polimixina B, de forma a garantir que, se algum LPS estiver presente nas amostras, os seus efeitos sejam mitigados. Além disso, a capacidade das NPs de atuarem como sistemas de entrega de fármacos foi confirmada através de ensaios de adsorção de proteínas com três proteínas modelo (albumina de soro bovino (BSA), mioglobina e lisozima), seguidos de estudos de uptake em PBMCs usando NPs com a proteína modelo BSA-FITC adsorvida à superfície.De forma geral, os resultados sugerem que as NPs de PLA são hemocompatíveis sem causarem reações inflamatórias e que as NPs de PLA que apresentam uma população de menor tamanho possuem uma citotoxicidade aumentada e capacidade para induzir a produção de ROS.Desta forma, este estudo enfatiza a importância da interpretação dos resultados com base numa caracterização físico-química adequada dos sistemas de entrega nanoparticulados em meios biológicos, uma vez que pequenas diferenças de tamanho desencadeadas pela dispersão nestes meios de cultura celular podem ter repercussões na toxicidade. Se não forem tidas em conta, estas diferenças podem levar a interpretações erradas e conclusões ambíguas.

Polylactic acid (PLA) is a FDA-approved biodegradable and biocompatible polymer derived fully from renewable resources, which has been widely used as a promising nanoparticulate delivery system. However, when used as a polymeric nanoparticle (NP), its immunotoxicological effects are not well-documented. Thus, this study intends to evaluate the toxicity of two different sized PL A NPs (PL AA NPs and PL AB NPs) after extensive physicochemical characterization in in vitro experimental conditions. Additionally, another two polymeric NPs were produced and used as terms of comparison: polycaprolactone (PCL) NPs and PCL/chitosan (PCL/CHI) NPs.After production, PLAA NPs mean diameter (187.9 ± 36.9 nm) was superior to PLAB NPs (109.1 ± 10.4 nm). Concerning the other polymeric NPs, PCL/CHI NPs presented a mean diameter (266.1 ± 63.8 nm) superior to PCL NPs (170.0 ± 15.2 nm) and a distinctive positive zeta potential, confirming the presence of CHI in the NP structure. However, when dispersed in cell culture media, all NPs presented different sizes, which we may explain their behavior in the assays performed.For instance, contrary to what was previously assessed in pyrogen-free water, in DMEM medium, PLAA NPs presented smaller mean diameter when compared to PLAB NPs, which may explain its higher toxicity in RAW 264.7, presenting an estimated IC50 of 540.6 μg/mL. The same happened with PCL/CHI NPs, which size drastically decreased in DMEM medium, and showed the highest toxicity among all NP tested, with an estimated IC50 of 68.89 μg/mL. Likewise, PLAA and PCL/CHI NPs were also the ones that induced a significant concentration-dependent ROS production.Irrespective of size differences, none of the polymeric NPs of this study, in concentrations tested, presented an inflammatory potential (NO production) in RAW 264.7, nor toxicity in PBMCs or hemolytic activity in human blood.Concerning cytokines release (TNF-α and IL-6) from human PBMCs, the presence of CHI in the PCL/CHI NPs structure seemed to exacerbate cytokines release when compared to PCL NPs. Nonetheless, both presented a higher increase of cytokines release when compare with PLA NPs. However, despite the use of 6 different blood donors, these results need to be repeated with more donors due to the great variability verified between individuals. Also, although the NPs are produced in endotoxin-free conditions, this study could be repeated in presence of polymyxin B, to guarantee that if any LPS was present in samples, its effect would be mitigated.Moreover, NPs ability to act as protein delivery systems was confirmed through protein adsorption assays with three model proteins (bovine serum albumin (BSA), myoglobin and lysozyme), followed by cell uptake studies in PBMCs using NPs adsorbed with the BSA-FITC model protein.Overall, the results suggest that PLA NPs are hemocompatible without causing inflammatory reactions and that PLA NPs presenting a smaller sized population possess increased cytotoxicity and ability to induce ROS production.Furthermore, this study emphasizes the importance of interpreting results based on adequate physicochemical characterization of the nanoparticulate delivery systems in biological media, since small differences in size triggered by the dispersion in cell culture media can be related to the differences on the cytotoxicity. If not accounted for, these differences can lead to misinterpretations, and subsequent ambiguous conclusions.