Inhibition of protein tyrosine phosphatase 1B as a novel therapy for chronic diabetic foot ulceration

Abstract

A prevalência da diabetes tem vindo a aumentar rapidamente e estima-se que mais de 400 milhões de pessoas sofram de diabetes em todo o mundo. Em Portugal, a prevalência da diabetes é uma das mais altas da Europa. A hiperglicémia persistente leva ao desenvolvimento de neuropatia periférica, doença arterial periférica e a um fluxo sanguíneo reduzido que, juntamente com infeções, são as principais causas para o desenvolvimento de úlceras do pé diabético (DFUs). Aproximadamente 15-25% dos pacientes diabéticos desenvolvem DFUs. Os tratamentos clássicos não são suficientes para tratar estas úlceras, das quais 10-15% se tornam úlceras crónicas que não curam, com 24% de probabilidade de uma futura amputação.A cicatrização normal de feridas compreende quatro fases: hemostase, inflamação, proliferação e maturação. Os macrófagos têm um papel importante em todas estas fases da cicatrização de feridas. Em feridas crónicas, a conversão dos macrófagos M1 em macrófagos M2 está comprometida, retardando a resolução da fase inflamatória e o processo de cicatrização da ferida.A proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) é expressa em vários tecidos, sendo um regulador negativo de várias vias metabólicas. Devido ao papel da PTP1B na modulação de várias vias de sinalização e uma vez que a PTP1B está sobre-expressa em condições diabéticas, vários estudos investigaram o seu papel na cicatrização de feridas.A principal hipótese deste trabalho é que a inibição tópica da PTP1B irá melhorar a reparação da ferida na diabetes. Para isso, células THP-1 cultivadas em condições de glucose normal (NG) e alta glucose (HG) e monócitos humanos, isolados do sangue de pacientes diabéticos com e sem DFUs, bem como de voluntários saudáveis, foram diferenciados em macrófagos e tratados com MSI-1436, um inibidor específico da PTP1B, para avaliar os efeitos da inibição da PTP1B na libertação de citocinas inflamatórias e mediadores da cicatrização de feridas nestas células. Nas células THP-1, a viabilidade foi medida usando o ensaio de MTT. O número de macrófagos M1 e M2 foi avaliado por imunocitoquímica, usando o duplo staining CD68 e TNF-α para macrófagos M1 e o duplo staining CD68 e CD163 para macrófagos M2. Além disso, a expressão de citocinas pró-inflamatórias foi analisada por qRT-PCR. Juntamente com o stress oxidativo, avaliado com o ensaio DCFH-DA, os níveis da enzima heme oxigenase-1 (HO-1) também foram medidos por imunohistoquímica e western blot. Nos monócitos humanos, a viabilidade e a expressão de citocinas pró-inflamatórias também foram analisadas. Para determinar se a inibição da PTP1B melhora a cicatrização de feridas em condições diabéticas in vivo, o MSI-1436 foi aplicado topicamente (no local da ferida) utilizando um modelo animal diabético, em que a diabetes foi induzida por estreptozotocina. As feridas dos ratinhos foram recolhidas e o número de macrófagos M1 e M2 foi avaliado por imunocitoquímica como realizado nas experiências de cultura celular. A vascularização da ferida foi avaliada através da deteção de células endoteliais usando o CD31 juntamente com os níveis de ROS que foram avaliados com o ensaio de DHE. A expressão de HO-1 também foi medida, assim como a presença de ki-67, um marcador de proliferação celular.O tratamento com MSI-1436 não alterou a viabilidade das células THP-1 nem dos monócitos humanos isolados. Em condições inflamatórias, as células THP-1 cultivadas em NG e HG e tratadas com MSI-1436 mostraram um aumento dos macrófagos M2 e uma redução no número de macrófagos M1, uma diminuição no ambiente pró-inflamatório, uma diminuição nos níveis de ROS e um aumento significativo na expressão de HO-1. A inibição da PTP1B em macrófagos derivados de monócitos humanos diminuiu o ambiente pró-inflamatório em condições diabéticas. Na experiência animal, a dose 1 µg de MSI-1436 provou ser a mais eficaz. A inibição da PTP1B em feridas de murganhos diabéticos levou a um maior número de macrófagos M2, a uma diminuição dos macrófagos M1 e a uma redução no ambiente pró-inflamatório. Além disso, esta inibição promoveu uma redução dos níveis de ROS, um aumento da vascularização, proliferação celular e expressão de HO-1 no local da ferida, promovendo uma cicatrização mais rápida da ferida.Os resultados mostraram que a inibição da PTP1B no local da ferida promove a cicatrização induzindo um aumento na expressão de HO-1, o que leva a um aumento na polarização dos macrófagos M2, a uma diminuição da inflamação, a uma diminuição do stress oxidativo e a um aumento da angiogénese e da proliferação. Estes efeitos irão promover uma cicatrização mais rápida e eficiente. A modulação local da PTP1B pode ser benéfica para o tratamento da cicatrização anormal de feridas na diabetes e a inibição da PTP1B é um potencial alvo terapêutico para o tratamento de úlceras crónicas do pé diabético.

Diabetes prevalence has been rapidly increasing and it is estimated that more than 400 million people suffer from diabetes worldwide. In Portugal, the prevalence of diabetes is one of the highest in Europe. The persistent hyperglycaemia leads to the development of peripheral neuropathy, peripheral arterial disease and reduced blood flow that, together with infections, are the main causes for the development of diabetic foot ulcers (DFUs). Approximately 15-25% of diabetic patients develop DFUs. Classic treatments are not sufficient to treat these ulcers from which 10-15% become chronic non-healing ulcers with 24% chance of future amputation.Normal wound healing comprises four phases: haemostasis, inflammation, proliferation and maturation. Macrophages have an important role in all wound healing phases. In chronic wounds, the conversion of M1 macrophages into M2 macrophages is compromised, delaying the resolution of the inflammatory phase and the wound healing process.Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) is expressed in various tissues being a negative regulator of several metabolic pathways. Due to the role of PTP1B in the modulation of several signalling pathways and since PTP1B is overexpressed in diabetic conditions, various studies have addressed its role in wound healing.The main hypothesis of this work is that topical inhibition of PTP1B will improve wound repair in diabetes. For that, THP-1 cells cultured under normal (NG) and high glucose (HG) conditions and human monocytes, isolated from the blood of diabetic patients with and without DFUs, as well as healthy volunteers, were differentiated into macrophages and treated with MSI-1436, a PTP1B specific inhibitor, to assess the effects of PTP1B inhibition on the release of inflammatory cytokines and wound healing mediators in these cells. In THP-1 cells, the viability was measured by MTT assay. The number of M1 and M2 macrophages was evaluated by immunocytochemistry, using the double staining of CD68 and TNF-α for M1 macrophages and the double staining of CD68 and CD163 for M2 macrophages. Moreover, the expression of pro-inflammatory cytokines was analysed by qRT-PCR. Along with oxidative stress, evaluated with the DCFH-DA assay, the levels of the enzyme heme oxygenase-1 (HO-1) were also measured by immunohistochemistry and western blot. In the human monocytes, the viability and the expression of pro-inflammatory cytokines were also analysed. To determine whether inhibition of PTP1B improves wound healing under in vivo diabetic conditions, MSI-1436 was applied topically (at the wound site) using the streptozotocin-induced diabetic mouse model. Mouse wounds were collected and the number of M1 and M2 macrophages was evaluated by immunocytochemistry as performed in cell culture experiments. The wound vascularisation was evaluated with the detection of endothelial cells using CD31 along with ROS levels that were evaluated by DHE assay. The HO-1 expression was also measured as well as the presence of ki-67, a cell proliferation marker.MSI-1436 treatment did not alter the viability of THP-1 cells or isolated human monocytes. Under inflammatory conditions, THP-1 cells cultured under NG and HG and treated with MSI-1436 showed an increase in M2 macrophages and a reduction in the number of M1 macrophages, a decrease in the pro-inflammatory environment, a decrease in ROS levels and a significant increase in HO-1 expression. PTP1B inhibition on human monocyte-derived macrophages decreased the pro-inflammatory environment in diabetic conditions. In the animal experiment the dose 1 µg of MSI-1436 proved to be the most effective. PTP1B inhibition in diabetic mouse wounds led to a higher number of M2 macrophages, to a decrease of M1 macrophages and to a reduction in the pro-inflammatory environment. Furthermore, this inhibition promoted a reduction of ROS levels, an increase in vascularisation, cell proliferation and HO-1 expression at the wound site, promoting a faster wound healing. The results showed that PTP1B inhibition at wound site promotes wound healing by inducing an increase in HO-1 expression, which in turn leads to an increase in M2 macrophage polarisation, a decrease in inflammation, a decrease in oxidative stress and an increase in angiogenesis and proliferation. These effects will promote a faster and more efficient wound healing. The local modulation of PTP1B may be beneficial in the treatment of impaired wound healing in diabetes and PTP1B inhibition is a potential therapeutic target for the treatment of chronic diabetic foot ulcers.