CRISPR/Cas9-mediated tagging of stem cell specific genes to study regeneration in the flatworm Macrostomum lignano

Abstract

A regeneração de tecidos é um processo que está dependente da capacidade de proliferação e diferenciação de células estaminais. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos neste processo são ainda uma incógnita, tornando ainda mais fascinante este atributo tão raro em alguns animais. Macrostomum lignano é um platelminta marinho que apresenta um conjunto qualidades únicas que fazem com que se adeqúe perfeitamente ao estudo de regeneração e células estaminais. É de fácil manutenção, transparente, tem um curto tempo de vida, produz ovos individuais fertilizados o que possibilita a criação de organismos transgénicos via micro-injecção. Além de todas as características descritas tem capacidade de regeneração ao longo do corpo, apenas possível devido à população pluripotente de células estaminais denominada neoblastos. O estudo dos neoblastos possibilita a compreensão dos mecanismos envolvidos no processo de regeneração.Neste estudo foi possível desenvolver linhas transgénicas de M. lignano que marcam os neoblastos pela integração de uma proteína fluorescente pelo sistema CRISPR/Cas9 no locus de um gene específico dos neoblastos, H2AX. Esta linha foi um ponto de partida para a criação de linhas transgénicas duplas que marcam neoblastos assim como variados tipos celulares com proteínas fluorescentes distintas. A expressão fluorescente de uma linha dupla que marca neoblastos e células musculares após amputação permitiu identificar células progenitoras, neoblastos destinados a se diferenciarem em determinado tipo celular. A criação destas linhas transgénicas possibilitou o acompanhamento in vivo do comportamento dos neoblastos no processo de regeneração assim como a separação de diferentes populações de neoblastos nunca identificadas.Além de nos dar uma perspectiva mais ampla da função dos neoblastos, este projecto permitiu a melhor compreensão do processo de diferenciação destas células após amputação. O desenvolvimento da tecnologia CRISPR/Cas9 posiciona Macrostomum lignano como o platelminta de eleição para o estudo de comportamento celular in vivo e para o estudo da genómica funcional dos neoblastos tanto em homeostasia como em regeneração. Também alarga o seu estudo em diferentes áreas como cancro, manutenção genómica e envelhecimento.

Regeneration of lost or damaged tissues is dependent on proliferation and differentiation of stem cells. The understanding of this molecular process is one of the longstanding scientific problems that require a suitable model organism. The recently developed model Macrostomum lignano is a marine free‐living flatworm with a unique set of biological properties perfectly positioned for the study of stem cells and regeneration. It is easy to culture, transparent, has a short generation time and produces single-cell fertilized eggs, enabling transgenesis via microinjection. Whole-body regeneration in flatworms is fueled by a pluripotent population of stem cells called neoblasts. Studying the biology of neoblasts improves our understanding of the mechanisms involved in regeneration. In the current project we were able to develop by microinjection a M. lignano transgenic line labeling neoblasts by CRISPR/Cas9‐mediated knock‐in of a fluorescent protein into a neoblast‐specific gene, H2AX. Such line was a starting point for generating multiple double transgenic lines labeling both neoblasts and differentiated cell types tagged with distinct fluorescent proteins. Fluorescent protein expression in a double transgenic line with a muscle-specific marker allowed identification of progenitor cells upon regeneration, a neoblast population committed to differentiate into specific cell-types. These transgenic lines allow for in vivo tracking of neoblast behavior during regeneration and isolation of several never identified stem cell populations for further characterization.This project improves our understanding of the molecular mechanisms of neoblast differentiation and provides a broader multidimensional image of the function of stem cells in the process of regeneration. The enlargement of its experimental potential places M. lignano as the invertebrate model organism of choice for studying in vivo cell behavior and stem cell-specific gene function in tissue regeneration and homeostasis. As well as expand its value in other research fields as cancer, genome maintenance and ageing.