Characterization of the intracelular signalling pathways mediating the effects of purinergic receptors in dendritic and axonal formation and outgrowth

Abstract

Adenosine triphosphate (ATP) is best known as the key molecule in bioenergetics and in multiple cellular processes, but it is now well-recognized as an extracellular signalling molecule as well. ATP can signal directly through the activation of P2Rs or indirectly through P1Rs activated by adenosine formed upon the extracellular catabolism of ATP by ecto-nucleotidases. In the adult brain, purinergic receptors display a widespread regional and cellular distribution, fulfilling a neurotransmitter and neuromodulatory role, controlling astrocytic function or formatting microgliaresponsiveness. Purinergic signaling also plays a role in brain development ranging from neurogenesis to neuronal migration, neuritogenesis and synaptogenesis. Particularly regarding neuronal development, it has been shown that P2Rs bidirectionally regulates axonal growth, promoting axonal elongation through P2Y1R and inhibiting it through P2Y13R and P2X7R. A2ARs also promotes axonal growth and dendritic branching in ratcortical neurons. Unpublished data from our group showed that A2ARs is not only involved in axonal growth but also in axon formation. This was observed both in vitro inmice cortical neurons and in vivo, since it is required for cortical principal neurons migration in the transition from the intermediate zone (IZ) to the cortical plate (CP).The bidirectional regulation of axonal growth by P2Rs was shown to be mediated by a convergent but differential regulation of adenylate cyclase 5 and PI3K-Akt-GSK3βpathway. The A2AR-driven axonal outgrowth in rat cortical neurons was also shown to involve PI3K. Yet, how the purinergic receptors are able to control both dendritic and axonal development remains ill-defined. One protein that might be targeted and mediating the effects of purinergic receptors in neuronal development is collapsin response mediator protein 2 (CRMP2), a microtubule-associated protein shown to contribute to dendritogenesis and axon specification and outgrowth, and critical in cortical principal neurons migration, precisely in the IZ-CP transition. CRMP2 is negatively regulated by phosphorylation by two independent pathways, one mediated by cyclin-dependent kinase (Cdk5) that phosphorylates S522, priming the phosphorylation of T514 by GSK3β, and the other mediated by Rho kinase at T555, also a target of PKC. Thus, to start addressing the putative involvement of CRMP2 regulation in the effects induced by purinergic receptors, it was necessary to evaluate the involvement of each of these kinases namely PKC, GSK3 and Rho kinase.E18-derived rat hippocampal neurons cultured in the presence of the selective A2AR agonist, CGS21680 (30 nM), from day in vitro 0 (DIV0) to DIV3 displayed an increase in the number of axons per neuron and longer axons, an effect not observed in cellselectroporated with shRNA-A2AR. Thus, in contrast to the observed in mice cortical neurons, where A2AR is tonically necessary for the formation of the normal axon, in rathippocampal neurons A2ARs are not involved in the formation of the normal axon.Instead, the exogenous activation of A2AR induces the formation of secondary axons. Moreover, A2ARs activation decreased dendritic length. Preliminary data indicate that all these effects depend on BDNF activity. Furthermore, we observed that P2Y1R does notcontrol axon formation, but it promotes axon outgrowth. The agonist of P2Y1, P2Y12 and P2Y13 receptors, ADPβS (5 μM), and the P2Y1R selective agonist, MRS2365 (100 nM), induced an increase in axon length, while the P2Y1R antagonist, MRS2179 (10 μM), caused a decrease in axon length, showing a tonic action of P2Y1R controlling axon outgrowth. The pharmacological blockade of P2X7R with BBG (100 nM) increased axonal length, indicating that P2X7R is tonically inhibiting axonal growth also in rat hippocampalneurons whilst not modifying dendritic morphology, as previously reported.All these effects were then evaluated in the presence of the kinase inhibitors. Itwas found that A2AR-driven axon elongation involves GSK3, whereas axon formation induced by A2AR was prevented in the presence of PKC and Rho kinase inhibitors. The inhibition of dendritic growth by A2ARs activation depends on PKC and Rho kinase. P2Y1Rpromotes axonal outgrowth through a PKC- and GSK3-dependent mechanism, whereas the inhibition of dendritic growth involves PKC- and Rho kinase.The identification of the enzymes involved in the control of dendritic and axonal development by A2AR- and P2Y1R - support and set the grounds to characterize the involvement of CRMP2 and hence fully identify the signaling pathways recruited by purinergic signaling in the control of neuronal development. Besides, this study also revealed region-specificity in the control of neuronal development by purinergic signalling that is now mandatory to be fully elucidated.

Adenosina trifosfato (ATP) tem um papel central como molécula energética e em múltiplos processos celulares, mas também desempenha um papel na sinalização extracelular. O ATP pode sinalizar ou pela ativação direta dos recetores P2 (P2Rs) ou através dos recetores P1 (P1Rs) ativados pela adenosina formada a partir do catabolismo extracelular de ATP pelas ecto-nucleotidases. No cérebro adulto, os recetores purinérgicos apresentam uma distribuição generalizada, contribuindo para afisiologia sináptica astrocítica e da microglia. A sinalização purinérgica também tem um papel no desenvolvimento do cérebro, nomeadamente na neurogénese, migração neuronal, neuritogénese e sinaptogénese. Em relação ao desenvolvimento neuronal, foi mostrado que os P2Rs podem regular bidireccionalmente o crescimento axonial, aumentando através dos P2Y1R e inibindo através dos P2Y13R e P2X7R. Os A2AR também promovem o crescimento axonial e a ramificação das dendrites em neurónios corticais de rato. Resultados não publicados do nosso grupo mostram que os A2AR estão também envolvidos na formação do axónio. Isto foi observado quer in vitro em neurónios corticais de ratinho, quer in vivo, sendo um processo necessário para a migração dos neurónios corticais principais na transição da zona intermédia (IZ) para a placa cortical (CP).Relativamente às vias de sinalização envolvidas, foi mostrado que a regulação bidirecional do crescimento axonial pelos P2Rs é mediada pela regulação convergente mas diferencial da adenilato ciclase 5 e da via PI3K-Akt-GSK3β. Foi mostrado também que o crescimento promovido pelos A2AR envolve PI3K. Contudo ainda não se sabe qual o(s) mecanismo(s) a jusante que medeia(m) o controlo por parte dos recetores purinérgicos do desenvolvimento das dendrites e axónios. Uma proteína que pode estar envolvida é a proteína collapsin response mediator protein 2 (CRMP2), uma proteínaassociada aos microtúbulos envolvida na dendritogénese e na especificação e crescimento axonial, e essencial na migração dos neurónios corticais principais, precisamente na transição IZ-CP. A CRMP2 é regulada negativamente por fosforilação através de duas vias independentes, uma mediada pela enzima cdk5 que fosforila o resíduo S522, que permite a fosforilação de T514 pela GSK3β, e a outra mediada pela Rho cinase no resíduo T555, que também pode ser fosforilada pela PKC. Para avaliar o possível envolvimento da CRMP2, foi neste estudo avaliado o envolvimento de cada um destas enzimas cinases, nomeadamente PKC, GSK3 e Rho cinase, nos efeitos induzidos pelos recetores purinérgicos.Em culturas primárias de neurónios de hipocampo de rato derivados de embriões E18, a exposição ao agonista seletivo dos A2AR, CGS21680 (30 nM), desde o dia in vitro 0 (DIV0) até DIV3 induziu um aumento no número de axónios e no seu comprimento, um efeito que não foi observado em neurónios eletroporados com shRNA-A2AR. Portanto, ao contrário do observado em neurónios corticais de ratinho, os A2AR não estão envolvidos na formação do axónio normal em neurónios de hipocampo de rato. Em vez disso, a ativação exógena dos A2AR promove a formação de axónios secundários. Em relação às dendrites, a ativação dos A2AR diminuiu o o seu comprimento. Resultados preliminares mostram que todos estes efeitos dependem de BDNF. Em relação ao P2Y1R, os resultados obtidos indicam que este recetor não controla a formação do axónio, mas promove o seu crescimento. O agonista dos recetores P2Y1,12,13, ADPβS (5 μM), e o agonista seletivo de P2Y1, MRS2365 (100 nM), induziram um aumento no comprimento do axónio, enquanto que o bloqueio farmacológico dos P2Y1R, com MRS2179 (10 μM), induziu uma diminuição no comprimento do axónio, demonstrando uma ação tónica dos P2Y1R no crescimento axonial. O bloqueio farmacológico do P2X7R com BBG (100 nM) aumentou o comprimento dos axónios, indicando uma inibição tónica do crescimento axonial, nãotendo modificado a morfologia das dendrites.Relativamente ao envolvimento das diferentes enzimas, os resultados demonstraram que o crescimento axonial induzido pela ativação dos A2AR envolve GSK3, enquanto que a formação de axónios secundários foi prevenida pela presença de inibidores da PKC e da Rho cinase. A inibição do crescimento das dendrites induzido pelo A2AR depende de PKC e Rho cinase. O P2Y1R promove o crescimento axonial por um mecanismo dependente de PKC e GSK3, enquanto que a inibição do crescimento das dendrites envolve PKC e Rho cinase.A identificação destas enzimas envolvidas no controlo do desenvolvimento de dendrites e axónios pelos A2AR e P2Y1R suportam a hipótese de haver um envolvimento de CRMP2 no controlo do desenvolvimento neuronal pelos recetores purinérgicos. Para além disso definem como poderá ser feita essa regulação, que terá que ser avaliadaexperimentalmente. Além disso, este estudo revelou que existem diferenças no controlo do desenvolvimento neuronal pelo sistema purinérgico em diferentes regiões que também será importante elucidar.