Modulation of Subventricular Zone Postnatal Neurogenesis: Actions of Exercise-Regulated Neurotrophic Factors and Cannabinoid Type 2 Receptor

Abstract

O cérebro adulto, apesar de ser maioritariamente constituído por células pós-mitóticas, é reconhecido por ter células estaminais neurais (NSCs) que tanto se podem diferenciar em neurónios como em glia. De facto, a neurogénese ocorre de forma constitutiva principalmente em dois nichos neurogénicos distintos, a zona subventricular (SVZ), ao longo das paredes laterais dos ventrículos laterais, e a zona subgranular (SGZ), no giro dentado (DG) do hipocampo, onde as NSCs se diferenciam em novos neurónios funcionais.O sistema endocanabinóide, que atua principalmente através dos recetores de canabinóides dos tipos 1 e 2 (recetores CB1 e CB2), é um importante regulador da função sináptica, especialmente por inibir a libertação de neurotransmissores. De notar que tem sido demonstrado na literatura que a modulação de ambos recetores regula a neurogénese ao influenciar a proliferação, diferenciação e maturação das NSCs.O exercício físico tem sido associado com a saúde do sistema nervoso central, tendo um impacto em diversos aspetos da atividade cerebral, tais como um claro benefício na aprendizagem e memória, assim como na proteção contra a neurodegeneração. Além disso, o exercício físico é considerado como um potenciador da neurogénese hipocampal e como um restabelecedor da neurogénese disfuncional na SVZ.Notavelmente, dados recentes mostraram uma interação entre o recetor CB2 e a sinalização do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) na neurogénese da SVZ e do DG, sendo o BDNF um dos principais fatores neurotróficos regulados pelo exercício físico. Por outro lado, foi mostrado que os endocanabinóides, através do recetor CB1, são necessários para os efeitos mediados pelo exercício na proliferação das NSC no hipocampo. No entanto, até à data, a combinação da modulação do recetor CB2 com o exercício físico nunca foi estudada, em relação à neurogénese pós-natal.Deste modo, este projeto teve como objetivo estudar a possibilidade de fatores neurotróficos regulados pelo exercício físico combinados com a modulação do recetor CB2 ter um possível impacto na neurogénese da SVZ.Para tal, abordagens in vitro e in vivo foram realizadas. In vitro, neuroesferas isoladas da SVZ de murganhos foram farmacologicamente tratadas com o agonista (HU-308) e o antagonista (AM630) do recetor CB2 e, fatores neurotróficos, como o BDNF, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator 1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) tendo sido realizada uma curva de concentração-resposta relativamente à morte celular, proliferação celular e diferenciação neuronal. Não foram verificadas diferenças significativas entre o controlo e as células tratadas no ensaio de morte celular usando o iodeto de propídio (PI). Além disso, não foram encontradas diferenças significativas na proliferação celular e diferenciação neuronal em qualquer tratamento testado isoladamente. Após a avaliação do papel de cada fator neurotrófico em diferentes aspetos neurogénicos, foram realizadas co-incubações com BDNF, IGF-1 ou VEGF em conjunto com o agonista do recetor CB2. A co-incubação de IGF-1 com HU-308 induziu um aumento significativo da proliferação celular. A co-incubação de BDNF e o agonista do recetor CB2 aumentou também significativamente o número de neurónios maduros.De modo geral, estes resultados in vitro sugerem um sinergismo entre os fatores neurotróficos regulados pelo exercício e o recetor CB2 na regulação da neurogénese pós-natal da SVZ.Em relação aos ensaios in vivo, o objetivo final deste projeto é avaliar o efeito do exercício físico e a modulação do recetor CB2 na neurogénese pós-natal. Antes de se começar o paradigma do exercício, a modulação do recetor CB2 foi estudada em relação ao comportamento animal. Para tal, os animais foram cronicamente injetados com 0.5 e 5 mg/kg de agonista (HU-308) ou antagonista (AM 630) do recetor CB2. O agonista do recetor CB2 induziu comportamento relacionado com ansiedade, observado tanto no teste de open field como no teste elevated plus maze. Por outro lado, o tratamento com o antagonista do recetor CB2 induziu um comprometimento no desempenho da memória episódica de longo prazo, observado no teste de novel object recognition. Adicionalmente, o tratamento com o antagonista do recetor CB2 mostrou tendência a promover o comportamento do tipo depressivo, observado no teste forced swim.Este estudo permitiu começar a desvendar o sinergismo entre exercício físico e a modulação do recetor CB2 na regulação da neurogénese da SVZ em adultos. Essa modulação pode ter um papel importante na neurogénese da SVZ pós-natal, o que pode ser relevante para futuras estratégias de medicina regenerativa para lesões ou doenças neurodegenerativas.

The adult brain, even though largely populated with postmitotic cells, is now known to have neural stem cells (NSCs) that can differentiate into both neurons and glia. Indeed, neurogenesis actively occurs in two primary neurogenic niches, the subventricular zone (SVZ), along the lateral walls of the lateral ventricles, and the subgranular zone (SGZ), in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, where the NSCs differentiate in new functional neurons.The endocannabinoid system, which acts mainly through cannabinoid type 1 and 2 receptors (CB1 and CB2 receptors), is a key regulator of synaptic function, especially by inhibiting neurotransmitter release. Importantly, it has been shown that modulation of both receptors regulates neurogenesis, by influencing NSC proliferation, differentiation and maturation.Physical exercise has long been associated with CNS health, having an impact on several aspects of brain function, such as clear benefit in learning and memory as well as protection from neurodegeneration. Moreover, physical exercise has been indicated as an enhancer of hippocampal neurogenesis and as a rescuer of defective SVZ neurogenesis.Notably, recent data sheds light on an interaction between CB2 receptor and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) signaling in SVZ and DG neurogenesis, being BDNF one of the most important exercise-regulated neurotrophic factors. Remarkably, evidence shows that endocannabinoids, via CB1 receptor, are required for exercise-mediated effects on hippocampal NSC proliferation. However, to date, the combination of CB2 receptor modulation with exercise has never been studied concerning postnatal neurogenesis.Therefore, this project aimed to study whether exercise-regulated neurotrophic factors combined with CB2 receptor modulation play an impactful role on SVZ neurogenesis. Therefore, in vitro and in vivo approaches were performed. In vitro, SVZ neurospheres isolated from P1-3 mice were pharmacologically treated with CB2 receptor agonist (HU-308), CB2 receptor antagonist (AM630) and neurotrophic factors namely BDNF, vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and a concentration-response curve for the ligands was assessed regarding cell death, cell proliferation and neuronal differentiation. No significant differences between control and treated cells were found in the cell death assay using propidium iodide (PI). Moreover, no significant differences were found in cell proliferation and neuronal differentiation with all tested drugs. After evaluating the independent role of each neurotrophic factor in the different neurogenic aspects, co-incubations with BDNF, VEGF or IGF-1 together with CB2 receptor agonist were performed. The co-incubation of IGF-1 with HU-308 promoted a significant increase in cell proliferation. Furthermore, the co-incubation of BDNF and CB2 receptor agonist significantly increased the number of mature neurons.Overall, these in vitro results suggest a putative synergism between exercise-mediated neurotrophic factors and CB2 receptor in regulating postnatal SVZ neurogenesis. Concerning in vivo, the ultimate goal of this project is to assess the effect of physical exercise and CB2 receptor modulation in postnatal neurogenesis. Before starting the exercise paradigm, the modulation of CB2 receptor was studied concerning animal behavior. For that, animals were chronically injected with 0.5 and 5 mg/kg of either the CB2 receptor agonist (HU-308) and antagonist (AM 630). CB2 receptor agonist induced anxiety-related behavior, as observed in both the open field and elevated plus maze tests. On the other hand, treatment with CB2 receptor antagonist promoted an impairment in episodic long-term memory performance, observed in the novel object recognition. Additionally, treatment with CB2 receptor antagonist shows a tendency to promote depressive-like behavior, observed in the forced swim test.This study will help to shed light in the putative synergism between physical exercise and CB2 receptor modulation in regulating adult SVZ neurogenesis. This modulation may have an impactful role on postnatal SVZ neurogenesis which might be relevant for future brain repair strategies.