Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/88072
Title: Role of the Adenine Nucleotide Translocator 2 in P19 Embryonal Carcinoma Stem Cells Mitochondrial Profile
Other Titles: Papel do Transportador de Nucleótidos de Adenina 2 no Perfil Mitocondrial de Células P19 Estaminais de Carcinoma Embrionário
Authors: Oliveira, Gabriela Lopes
Orientador: Moreno, António Joaquim de Matos
Marques, Ricardo Jorge Fernandes
Keywords: Transportador de nucleótidos de adenina 2; Células estaminais cancerígenas; Mitocôndria; Remodelação metabólica; Adenine nucleotide translocator 2; Cancer stem cells; Mitochondria; Metabolic remodeling
Issue Date: 18-Sep-2019
Serial title, monograph or event: Role of the Adenine Nucleotide Translocator 2 in P19 Embryonal Carcinoma Stem Cells Mitochondrial Profile
Place of publication or event: UC-Biotech
Abstract: Cancer is considered a heterogenous tissue of several cell types, which have different phenotypes, functions and state of differentiation. Cancer stem cells (CSCs) are amongst the group of cells constituting tumors, being characterized by their strong self-renewal and survival properties. Moreover, they are believed to be responsible for driving new tumors formation and to be more resistant to conventional anticancer therapies than the other cells present within the tumor, which makes them clinically relevant. There are several common functional features among cancer cells, known as the hallmarks of cancer, which include the ability that these cells have to remodel their cellular metabolism. Cancer cells, CSCs included, are thought to rely mostly on glycolysis, even in the presence of oxygen, which confers them adaptative advantages. Adenine nucleotide translocator 2 (ANT2), responsible for the ATP uptake into the mitochondria, has been correlated with a higher glycolytic metabolism and are known to be overexpressed in cancer cells. Thus, our aim was to evaluate ANT2 role in cell growth and in the remodeling of mitochondrial metabolism of CSCs. Using P19 embryonal carcinoma stem cells (P19SCs) as a CSCs model, we analyzed ANT2 expression levels comparing them to their differentiated counterparts. Furthermore, ANT2-siRNA was utilized as a tool to inhibit ANT2 translation, in order to evaluate several parameters regarding cell growth, mitochondria remodeling and cellular metabolism. We showed that ANT2 isoform is overexpressed in P19SCs relatively to P19 derived differentiated cells. Upon ANT2 silencing, metabolic activity and cell mass were measured by sulforhodamine B (SRB) and resazurin assays, respectively, and both were decreased after 48 and 72 hours of transfection. Additionally, by measuring oxygen consumption rate (OCR) using Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer, we observed a decreased on mitochondrial respiration after 48 hours of transfection, which was not accompanied by a decreased on mitochondrial content, since TOM20 protein levels and mitochondrial network area were not affected. Mitochondrial membrane potential was evaluated by fluorescence microscopy imaging using Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), with silenced cells presenting more depolarized mitochondria. Metabolic-related enzymes, mitochondrial dynamics and biogenesis were evaluated by Western blotting and no differences were found in pyruvate kinase muscle isozyme M2 (PKM2), mitofusin 1 (MFN1) and dynamin-related protein-1 (DRP1) expression levels, however, hexokinase II (HKII), Pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1-alpha (PGC-1-α) and Mitochondrial transcription factor A (TFAM) were decreased after ANT2 silencing.Our findings demonstrate that ANT2 is more expressed in P19SCS when compared to their differentiated counterparts. Additionally, ANT2 silencing seems to promote a decrease in cell growth and a metabolic adaptation in CSCs towards a less oxidative phenotype, although having the same amount of mitochondria. Albeit mitochondrial dynamics seemed not to be affected, mitochondrial biogenesis was decreased by around 25% upon ANT2 silencing. Based on our data and on the increasing evidence that ANT2 plays a role in the metabolic remodeling of CSCs, ANT2 could be a promising metabolic target for anticancer therapy against CSCs.
O cancro é considerado um tecido heterogéneo composto por vários tipos de células, que possuem diferentes fenótipos, funções e estados de diferenciação. As células estaminais cancerígenas (CSCs) estão entre o grupo de células que constituem os tumores, sendo caracterizadas pelas suas fortes propriedades de autorrenovação e sobrevivência. Além disso, acredita-se que sejam responsáveis pela formação de novos tumores e serem mais resistentes às terapias anticancerígenas convencionais do que as restantes células presentes no tumor, o que as torna clinicamente relevantes. Existem várias características funcionais comuns entre as células cancerígenas, conhecidas como os hallmarks do cancro, que incluem a capacidade que estas células têm de remodelar o seu metabolismo celular. Acredita-se que as células cancerígenas, incluindo as CSCs, dependam principalmente da glicólise, mesmo na presença de oxigênio, o que lhes confere vantagens adaptativas. O transportador de nucleotídeos de adenina 2 (ANT2), responsável pela importação de ATP para a matriz mitocondrial, tem sido correlacionado com um metabolismo glicolítico mais elevado e sabe-se que é sobre expresso em células cancerígenas. Assim, o nosso objetivo foi avaliar o papel do ANT2 na proliferação celular e na remodelação do perfil mitocondrial, bem como no metabolismo das CSCs. Usando as células P19 estaminais de carcinoma embrionário (P19SCs) como modelo de CSCs, analisámos os níveis de expressão de ANT2 comparativamente com suas contrapartes diferenciadas (P19dCs). Além disso, ANT2-siRNA foi utilizado como ferramenta para inibir a tradução de ANT2, a fim de avaliar vários parâmetros em relação ao crescimento celular, remodelação mitocondrial e metabolismo celular. Neste trabalho demonstramos que a isoforma ANT2 é sobre expressa em P19SCs relativamente às P19dCs. Após o silenciamento do ANT2, a atividade metabólica e a massa celular foram medidas usando sulforrodamina B (SRB) e resazurina, respetivamente, e ambos diminuíram após 48 e 72 horas de transfeção. Além disso, medindo a taxa de consumo de oxigénio (OCR) usando Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyser, observámos uma diminuição na respiração mitocondrial após 48 horas de transfeção, o que não foi acompanhado por uma diminuição no conteúdo mitocondrial, uma vez que os níveis proteicos de TOM20 e a área da rede mitocondrial não foram afetados. O potencial de membrana mitocondrial foi avaliado por microscopia de fluorescência usando metil éster de tetrametilrodamina (TMRM), sendo possível observar que as células silenciadas apresentam mitocôndrias mais despolarizadas. Dinâmica e biogénese mitocondrial, e enzimas relacionadas com o metabolismo foram avaliadas por Western blotting e não foram encontradas diferenças nos níveis de expressão de isoenzima piruvato cinase M2 (PKM2), mitofusina 1 (MFN1) e proteína relacionada à dinamina 1 (DRP1) mas, no entanto, hexocinase II (HKII), piruvato desidrogenase cinase (PDK), coativador do receptor-gama ativado por proliferador de peroxissoma 1-alfa (PGC-1-α) e fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) diminuíram após o silenciamento do ANT2.Os nossos resultados demonstram que o ANT2 é mais expresso nas P19SCS do que nas P19dCs. Adicionalmente, o silenciamento de ANT2 parece promover uma diminuição no crescimento celular e uma adaptação metabólica nas CSCs para um fenótipo menos oxidativo, embora tenham a mesma quantidade de mitocôndrias. Ainda que a dinâmica mitocondrial pareça não ter sido afetada, a biogénese mitocondrial apresenta uma diminuição de cerca de 25% com o silenciamento do ANT2. Com base nos nossos dados e na crescente evidência de que o ANT2 desempenha um papel na remodelação metabólica das CSCs, o ANT2 poderá ser um alvo metabólico promissor para a terapia anticancerígena de CSCs.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/88072
Rights: embargoedAccess
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