Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/88056
Title: Mitochondria-based screening of drug neurotoxicity in differentiated SH-SY5Y cells
Other Titles: Triagem de marcadores da função mitocondrial após indução de neurotoxicidade em células SH-SY5Y diferencidas
Authors: Ferrão, Rafaela Margarida Cura
Orientador: Moreno, António Joaquim de Matos
Oliveira, Maria Teresa Martins da Cunha
Keywords: Disfunção mitocondrial; Biossensor; Drogas de abuso; Neurotoxicidade; Células SH-SY5Y; Mitochondrial dysfunction; Biosensor; Drugs of abuse; Neurotoxicity; SH-SY5Y cells
Issue Date: 16-Sep-2019
Serial title, monograph or event: Mitochondria-based screening of drug neurotoxicity in differentiated SH-SY5Y cells
Place of publication or event: DCV
Abstract: Drogas de abuso afetam a mitocôndria e a sua toxicidade mitocondrial pode ser responsável pelos processos de neurodegeneração. Compreender os mecanismos responsáveis pela toxicidade mitocondrial pode possibilitar o desenvolvimento de estratégias para impedir a neurodegeneração e permitir a previsão do potencial tóxico de novos compostos. Neste trabalho, o nosso objetivo foi identificar marcadores que precedem a neurotoxicidade caracterizada pela perda de viabilidade celular e perceber como é que a mitocôndria intervém na toxicidade celular induzida por drogas de abuso. A primeira tarefa baseou-se na caracterização da ordem cronológica de eventos que precedem a morte celular neuronal desencadeada por drogas de abuso clássicas pertencentes a diferentes classes, incluindo Cocaína, metanfetamina (METH) e Metadona. A segunda tarefa envolveu a aplicação do conhecimento obtido com as drogas clássicas para caracterizar a neurotoxicidade de Mescalina (MESC) e de drogas de desenho como 2,5-dimetoxi-4-bromo-anfetamina (DOB) e 3,4-Metilenodioxianfetamina (MDA).Células SH-SY5Y foram diferenciadas de modo a obter-se um fenótipo neuronal. As células foram expostas a diferentes concentrações das drogas clássicas e os seus efeitos foram analisados após diferentes tempos de exposição, medindo o conteúdo de espécies reativas de oxigénio (ERO) (0-12h), viabilidade celular (ATP (24h), atividade metabólica e massa celular (24-72h)), ativação das caspases 3 e 7 (24h) e perda da integridade da membrana celular (usando Hoechst 33342/Iodeto de Propídeo) (72 e 96h). A polarização mitocondrial e a extensão da rede mitocondrial polarizada foram analisadas usando MitoTracker™ Red CMXRos (24h). O número de cópias do DNA mitocondrial também foi determinado. A significância estatística foi estabelecida para valores de P<0,05. Durante a primeira hora de incubação não houve alterações significativas no conteúdo de EROs no caso da Cocaína e METH; no entanto, para Metadona (0,0391mM) foi observada uma diminuição clara. Após 6h de incubação com 5,00mM de Cocaína, os níveis de EROs parecem ter atingido um plateau. Para o mesmo período, as concentrações de 2,50 e 5,00mM de Cocaína provocaram um aumento significativo no conteúdo de EROs. A exposição a METH e Metadona durante 12h pareceu aumentar ligeiramente os níveis de EROs, mas, curiosamente, não para as concentrações mais altas.Após 24h de exposição, a polarização mitocondrial foi distintamente afetada pelas diferentes drogas de abuso, tendo diminuído para as concentrações mais altas de Cocaína (2,50 e 10,0mM) e aumentado para as concentrações mais altas de METH (0,313 a 2,50mM). A polarização mitocondrial aumentou significativamente para concentrações mais baixas de Metadona (0,0391 e 0,0781mM) e diminuiu ligeiramente para concentrações mais altas (0,156 e 0,313mM). A extensão da rede mitocondrial polarizada diminuiu significativamente para as concentrações mais elevadas de todos os compostos testados (5,00 e 10,0mM de Cocaína, 2,50mM de METH, 0,156 e 0,0313mM de Metadona). Além disso, após 24h, observou-se uma ativação das caspases 3/7 para as concentrações de 2,50 mM de Cocaína, 1,25mM METH e 0,156mM de Metadona. As drogas de abuso (às concentrações testadas) não induziram alterações significativas no número de cópias do mtDNA.Todas as drogas de abuso induziram uma diminuição dependente da dose na viabilidade celular às 24, 48 e 72h de exposição, em comparação com o controlo. O cálculo dos IC50s, com 24, 48 e 72h de exposição, mostrou que a Metadona apresentou o perfil mais tóxico, seguida pela METH e, por fim, a Cocaína. As drogas de abuso testadas também induziram perda da integridade membranar celular em concentrações mais altas (5.00mM de Cocaína, 1.25 e 2.50mM METH e 0.0781 e 0.156mM Metadona) após 72h, e também para as concentrações de 2.50mM METH e 0.156, 0.313mM Metadona, após 96h.De seguida, avaliou-se a viabilidade celular após exposição a DOB, MDA e MESC de forma a compreender se os mecanismos subjacentes à toxicidade dos derivados são comparáveis aos observados para as drogas clássicas. Resultados preliminares indicaram que DOB foi o composto mais tóxico, e que MDA e MESC parecem induzir efeitos semelhantes. A DOB, à concentração de 0.200mM, também aumentou significativamente a ativação das caspases 3/7, após 24h.Já que DOB e MDA, são derivados da estrutura da anfetamina e similares à MESC, os dados podem contribuir para o estabelecimento de uma relação de estrutura-toxicidade entre compostos clássicos e drogas de desenho, com foco na função mitocondrial. Alterações na estrutura química das drogas clássicas, como a anfetamina, parecem afetar diferentemente a toxicidade associada a cada composto derivado. Em conclusão, os resultados sugerem que a disfunção mitocondrial precoce pode ser um marcador sensível e confiável que precede alterações na viabilidade celular, sendo um evento preditor da neurotoxicidade de drogas que pode ser útil para caracterizar novos compostos.
Toxic compounds known to affect mitochondria include several drugs of abuse, and their mitochondrial toxicity may underlie neurodegeneration associated with drug addiction. Understanding the mechanisms of drug-induced mitochondrial toxicity may allow the development of strategies to counteract neurodegeneration and the prediction of potential toxicity of new compounds with related properties. In this work, our objective was to identify experimental end-points that predict neurotoxicity before the onset of cell viability loss and understand how mitochondria mediate the toxicity of drugs of abuse. Our first task relied on the characterization of the timeline of events that precede neuronal cell death triggered by classic drugs of abuse from different classes, including Cocaine, Methamphetamine (METH) and Methadone. The second task involved applying the knowledge obtained with classical drugs to characterize the neurotoxicity of Mescaline (MESC) and the designer drugs, 2,5-dimethoxy-4-bromo-amphetamine (DOB) and 3,4-Methylenedioxyamphetamine (MDA).SH-SY5Y cells were differentiated for 3 days into a neuron-like phenotype that was further characterized.Differentiated SH-SY5Y cells were then exposed to different concentrations of the classical drugs of abuse. The effects of these drugs were analyzed at different timepoints (0-96h) by measuring cellular reactive oxygen species (ROS) content (0-12h), cell viability (ATP content (24h), metabolic activity and cell mass (24-72h)), activation of caspase 3/7 (24h) and loss of cellular membrane integrity (by using Hoechst 33342/Propidum Iodide) (72 and 96h). Mitochondrial polarization and polarized mitochondrial network extension were analyzed after 24h, using MitoTracker™ Red CMXRos. Mitochondrial DNA copy number alterations were also determined for selected treatments. Statistical significance was set at P<0.05.During the 1st h of incubation, there were no significant alterations in ROS content for Cocaine and METH; however, at 0.0391mM Methadone, an evident decrease was observed. After 6h incubation with 5.00mM Cocaine, ROS levels reached a plateau. At this timepoint, 2.50 and 5.00mM Cocaine triggered a significant increase in ROS content, compared to control. METH and Methadone exposure at 12h seemed to slightly increase the ROS levels but, interestingly, not for the highest concentrations. After 24h, mitochondrial polarization was differently affected by the drugs of abuse, being decreased for higher concentrations of Cocaine (2.50 and 10.0mM) and increased for higher concentrations of METH (0.313 to 2.50mM). Mitochondrial polarization was significantly increased for lower concentrations of Methadone (0.0391 and 0.0781mM) and was slightly decreased for higher concentrations (0.156 and 0.313mM). Polarized mitochondrial network extension was significantly decreased for the higher concentrations of all the compounds tested (5.00 and 10.0mM Cocaine, 2.50mM METH, 0.156 and 0.0313mM Methadone). Also, after 24 h, activation of caspases 3 and 7 was observed for 2.50mM Cocaine, 1.25mM METH and 0.156mM Methadone. The drugs did not induce any significant alterations in mtDNA copy number. All drugs of abuse induced a clear dose-dependent decrease in cell viability at 24, 48 and 72h of exposure, as compared to the control. The calculation of IC50s, at 24, 48 and 72h of exposure, showed that Methadone was the most toxic drug, followed by METH and Cocaine. The tested drugs of abuse also induced loss of membrane integrity at higher concentrations (5.00mM Cocaine, 1.25 and 2.50mM METH and 0.0781 and 0.156 Methadone) after 72h, and, for 2.50mM METH and 0.156 and 0.313 Methadone also after 96h.Cell viability parameters were also assessed after DOB, MDA and MESC exposure for 24, 48 and 72h, to understand how the underlying mechanisms of toxicity of the derivatives can be compared to those observed for the selected classical drugs. Preliminary results indicate that DOB was the most toxic compound to differentiated SH-SY5Y cells and that MDA and MESC induced similar effects. DOB (0.200mM) also significantly increased the activation of caspases 3 and 7 after 24h. Since DOB and MDA are derived from the amphetamine structure and similar to MESC, and our data may contribute to the establishment of a structure-toxicity relationship between classical compounds and designer drugs, focusing on mitochondrial function. In conclusion, the results suggest that early mitochondrial dysfunction can be a sensitive and reliable marker that precedes later changes in cell viability, being a promising predictor of drug neurotoxicity that can be useful to characterize new designer drugs.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/88056
Rights: embargoedAccess
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