Estudos de dinâmica molecular em endonucleases de restrição do tipo 2 de raro corte - Estudo da enzima SgrAI

Abstract

A enzima SgrAI pertence às endonucleases de restrição do tipo IIF. É descrita como altamente específica devido não só à sua sequência de reconhecimento de 8 pares de bases, bem como tendo modulação alostérica. Porém, a reação de catálise da SgrAI ainda se encontra muito pouco caracterizada e, apesar de se esperar que esta ocorra da mesma forma que as enzimas que usam o mesmo cofator, dois iões de Mg2+, ainda não há evidências publicadas.Dessa forma, o objetivo deste e trabalho passa por caracterizar em detalhe as ligações entre o complexo enzima/DNA e a especificidade das mesmas através de métodos baseados em dinâmica molecular clássica e métodos de Mecânica Quântica/Mecânica Molecular (QM/MM).Para este estudo foram utilizados quatro modelos da enzima SgrAI, mais concretamente a forma de dímero, dímero com uma mutação num dos pares de bases, em forma de tetrâmero com iões de Ca2+ e na forma de tetrâmero com iões de Mg2+. Tanto para os modelos diméricos como para o modelo tetramétrico com iões de Ca2+ apenas foram realizadas simulações de dinâmica molecular para a estrutura inicial. Para o modelo tetramérico com iões de Mg2+, descrito como sendo a forma mais eficiente da SgrAI, o estudo prosseguiu utilizando métodos QM/MM, com a lisina em diferentes estados de protonação, para caraterizar o mecanismo de catalítico da enzima. Em todas as hipóteses testadas a posição do segundo ião magnésio revelou-se problemática e as barreiras de energia livre associadas foram sempre demasiado elevadas para sistemas biológicos. Este facto leva-nos a propor que o mecanismo para esta enzima poderá ter variações em relação ao mecanismo dos dois iões metálicos.

The SgrAI enzyme belongs to the type IIF restriction endonucleases. It is described as being highly specific due not only to its 8 base pair recognition sequence as well as having allosteric modulation. However, the catalysis reaction of SgrAI is still poorly characterized and although it is expected to occur in the same way as the enzymes that use the same cofactor, two Mg2+ ions, there is still no published evidence. Thus, the purpose of the present work is to characterize in detail the interactions between the enzyme/DNA complex and the specificity of the same through Classical molecular dynamics and Quantum Mechanics/Molecular Mechanics (QM/MM) methods.In order to attain that objective four models were used, namely SgrAI in the form of dimer, dimer with a mutation in one of the bases, in the form of tetramer with Ca2+ ions and in the form of tetramer with Mg2 + ions. The initial structures for the dimeric models and the tetrameric model with the Ca2+ ions were subjected to Molecular Dynamics (MD) simulations. The tetrameric model with Mg2+ ions, which is described as the most efficient form of SgrAI, was also studied using QM/MM methods with the lysine in different protonation states. In all tested hypothesis, the position of the second metal ion was problematic and the associated free energy barriers were too high for a biological reaction. This led us to propose that, for this specific case, there could be deviations to the archetypal two-metal ions catalysis mechanism.