A Validated Methodology for the Forensic Toxicological Analysis of Opioids in Biological Fluids Using Solid Phase Extraction, Microwave Derivatization and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Abstract

O desenvolvimento do presente estudo tornou-se pertinente devido ao consumo indevido de opióides e ao número de mortes por overdoses associadas ao seu consumo, tanto em Portugal como no resto do mundo. Por outro lado, sendo o recurso a matrizes biológicas postmortem alternativas ao sangue, uma área de crescente interesse em toxicologia forense estudámos a viabilidade do uso do líquido pericárdico na determinação das substâncias selecionadas.Assim, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento, otimização e validação de uma metodologia analítica para a determinação qualitativa e quantitativa de alguns opióides em sangue e líquido pericárdico.Os opióides estudados foram: morfina, codeína, 6-acetilmorfina, 6-acetilcodeína, oxicodona, oximorfona e o fentanil.O estudo incluiu a otimização do procedimento analítico e do método cromatográfico. Otimizámos a extração em fase sólida (SPE), a derivatização com e sem recurso a hidroxilamina aquosa a 1% e o tempo de derivatização induzida por micro-ondas com o reagente químico MSTFA (n-metil-n-(trimetilsilil) trifluoroacetamida)+5% TMCS (trimetilclorosilano).O método mais eficiente e seletivo correspondeu ao seguinte procedimento: precipitação com acetonitrilo de volumes de 250 μL de amostras de sangue e de líquido pericárdico, derivatização das substâncias de interesse usando 1% hidroxilamina aquosa em PBS (1:2, v/v) promovida por irradiação de micro-ondas, durante 30 segundos com uma potência de 900 W a 50%. Procedeu-se à extração dos analitos de interesse por SPE. Após evaporação dos eluatos (sob corrente de azoto a 40 ᵒC) os extratos foram derivatizados com MSTFA+5% TMCS sob ação de micro-ondas durante 100 segundos com uma potência de 900 W a 100%. Seguidamente os extratos derivatizados foram injetados (2 μL, splitless) diretamente no sistema de cromatografia de gases associado à espectrometria de massas (GC-MS-EI) com monitorização dos iões selecionados (modo SIM) e com o forno à temperatura inicial de 50 ᵒC.Após a otimização, o método foi validado seguindo as normas da Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX) de forma a garantir que o método é adequado para os fins a que se destina e assim atestar a sua fiabilidade na interpretação dos resultados analíticos. O método apresentou linearidade no intervalo 5-1000 ng/mL com coeficientes de determinação superiores a 0.99 para todos os analitos. Os limites de deteção (LOD) variaram entre 3 e 4 ng/mL, dependendo da substância e/ou da matriz analisada e os limites de quantificação (LOQ) foram de 5 ng/mL para todas as substâncias. Em relação às precisões (intra-dia e intermédia) todos os níveis de concentração apresentaram valores de CV <20% e a exatidão situou-se dentro do intervalo ±20%.Verificou-se ainda que as substâncias apresentaram estabilidade sob as seguintes condições: nos extratos deixados no amostrador em condições ambientais por pelo menos 24 h; nas amostras de sangue e líquido pericárdico deixadas na bancada de trabalho durante 4 h e nas amostras de líquido pericárdico durante 3 ciclos de congelação e descongelação ao longo de pelo menos 4 semanas.Por fim, a metodologia analítica foi aplicada a amostras reais disponibilizadas pelo Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P..De acordo com a revisão bibliográfica efetuada, este foi o primeiro método desenvolvido para a deteção e quantificação simultânea deste grupo de substâncias em sangue e líquido pericárdico com recurso à derivatização promovida por micro-ondas com os reagentes químicos hidroxilamina e MSTFA+5% TMCS.

The development of the present study became pertinent due to the misuse of opioids and the number of overdose deaths associated with its use, both in Portugal and in the rest of the world. On the other hand, being the use of alternative biological matrices to postmortem blood, an area of growing interest in forensic toxicology, we studied the feasibility of using pericardial fluid in the determination of the selected substances.Thus, the objective of this work was the development, optimization and validation of an analytical methodology for the qualitative and quantitative determination of some opioids in blood and pericardial fluid.The opioids studied were: morphine, codeine, 6-acetylmorphine, 6-acetylcodeine, oxycodone, oxymorphone and fentanyl.The study included the optimization of the analytical procedure and the chromatographic method. We have optimized solid phase extraction (SPE), derivatization with and without 1% aqueous hydroxylamine and microwave derivatization time with the chemical reagent MSTFA (n-methyl-n-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide)+5% TMCS (trimethylchlorosilane).The most efficient and selective method was as follows: precipitation with acetonitrile of 250 μL volumes of blood and pericardial fluid samples, derivatization of the substances of interest using 1% aqueous hydroxylamine in PBS (1:2, v/v) with microwave action for 30 seconds with a power of 900 W at 50%. The samples were cooled and then the analytes of interest were extracted by SPE. After evaporation of the eluates (under nitrogen stream at 40 °C) the extracts were derivatized with MSTFA+5% TMCS under microwave action for 100 seconds with a power of 900 W at 100%. Then the derivatized extracts were injected (2 μL, splitless) directly into a gas chromatography mass spectrometry system (GC-MS-EI) with selective ion monitoring mode (SIM mode) and with the oven at the initial temperature of 50 °C.After optimization, the method was validated following the standards of the Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX) to ensure that the method is suitable for its intended purpose and thus attest to its reliability in interpreting the analytical results. The method presented linearity in the range 5-1000 ng/mL with coefficients of determination above 0.99 for all analytes. The limits of detection (LOD) ranged from 3 to 4 ng/mL, depending on the substance and/or matrix analysed and the limits of quantitation (LOQ) were 5 ng/mL for all substances. Regarding the precision (intra-day and intermediate) all concentration levels presented CV values <20% and the bias was within ±20%. It was also verified that the substances presented stability under the following conditions: in the extracts left in the autosampler under environmentalconditions for at least 24 h; blood and pericardial fluid samples on the workbench for 4 h; pericardial fluid samples for 3 freeze-thaw cycles for at least 4 weeks.Finally, the analytical methodology was applied to real samples provided by the Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (Forensic Chemistry and Toxicology department of the Centre Branch of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences, I.P.).According to the literature review, this was the first method developed for the simultaneous detection and quantification of this group of substances in blood and pericardial fluid using microwave induced derivatization with the chemical reagent’s hydroxylamine and MSTFA+5% TMCS.