Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/87922
Title: Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
Other Titles: Performance mitocondrial durante a diferenciação de osteoblastos: à procura de novos alvos para contrariar a osteoporose
Authors: Valente, Sara Cristiana Alves
Orientador: Moreno, António Joaquim de Matos
Oliveira, Vilma Marisa Arrojado Soares Sardão
Keywords: Osteoporose; Osteoblasto; Menopausa; Estradiol; Mitocôndria; Osteoporosis; Osteoblast; Menopause; Estradiol; Mitochondria
Issue Date: 10-Sep-2019
Serial title, monograph or event: Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
Place of publication or event: UC-Biotech
Abstract: A osteoporose é uma doença crónica e assintomática caracterizada pela perda de densidade óssea e pela deterioração estrutural do osso. Isto leva à diminuição da resistência óssea e aumento do risco de fraturas, suscetível de gerar incapacidade física e dependência de terceiros. O decréscimo dos níveis de estrogénios que ocorre nas mulheres após a menopausa aumenta a fragilidade óssea. A osteoporose é, portanto, uma grande preocupação para as mulheres em processo de envelhecimento após a menopausa. O aumento da taxa de perda óssea observada em mulheres na pós-menopausa resulta de um desequilíbrio entre a reabsorção óssea pelos osteoclastos e a formação de novo osso pelos osteoblastos. Como este processo é precedido por uma diminuição nos estrogénios circulantes, este fenómeno poderá ser regulador da atividade e/ou diferenciação das células remodeladoras do osso. As mitocôndrias desempenham um papel importante na função celular dos osteoblastos; no entanto, a interação entre as mitocôndrias, a fisiologia dos osteoblastos, a perda de massa óssea e a sinalização de estrogénios permanece pouco estudada. O principal objetivo deste estudo foi investigar as alterações no metabolismo celular durante a diferenciação de osteoblastos, e como é que o estradiol regula este processo. Para atingir o nosso objetivo, utilizámos células MC3T3-E1 como modelo celular e induzimos a diferenciação em osteoblastos pela adição de 50 μg / mL de ácido ascórbico e 10 mM de β-glicerofosfato na presença e ausência de estradiol. Os resultados obtidos do ensaio de Alizarina S demonstraram que, nas nossas condições experimentais, as células MC3T3-E1 foram capazes de se diferenciar em osteoblastos funcionais capazes de depositar matriz mineralizada. No entanto, como visto pela técnica de Western Blot, os marcadores osteoblásticos Osteocalcina e Runx2 não apresentaram diferenças entre células controlo indiferenciadas e células diferenciadas por 48h. Além disso, pela medição da taxa de consumo de oxigénio (OCR) e da taxa de acidificação extracelular (ECAR) usando um Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer, mostrámos uma diminuição na acidificação do meio (uma medida indireta da via glicolítica) e na respiração mitocondrial durante as fases iniciais da diferenciação osteoblástica (24 e 48h). Os níveis proteicos da enzima mitocondrial superóxido dismutase (SOD2) também diminuíram após 24 e 48 horas de exposição às condições de diferenciação. Além disso, mostrámos evidências de que o E2 na concentração de 10 nM estimulou a mineralização de células MC3T3-E1, enquanto que a deficiência de estrogénios diminuiu a respiração mitocondrial durante as fases iniciais da diferenciação osteoblástica. Os níveis de proteína da SOD2, Sirt3 e TOM20 não foram afetados pela deficiência de estrogénio. Além disso, o número de cópias do mtDNA, conforme determinado por qRT-PCR, não se mostrou afetado pela diferenciação nem pela mimetização de deficiência de estrogénios. Os antagonistas dos recetores de estrogénio ERα (MPP, 10 nM) e ERβ (PHTPP, 10 nM) foram utilizados para estudar o papel de cada recetor de estrogénio na diferenciação e no desempenho mitocondrial nos osteoblastos. Embora os resultados com os antagonistas dos recetores de estrogénio não tenham sido conclusivos em relação à respiração mitocondrial, houve uma clara diminuição na mineralização quando o antagonista do ERα foi adicionado ao meio de diferenciação. A morfologia da rede mitocondrial e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados por microscopia de fluorescência usando o corante TMRM. Os resultados mostraram que estes parâmetros não foram afetados pelos tratamentos com E2, MPP ou PHTPP. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a deficiência de estrogénios leva ao comprometimento do desempenho mitocondrial, revelando a mitocôndria dos osteoblastos como um potencial alvo para terapias de prevenção e tratamento para a osteoporose.
Osteoporosis is an asymptomatic chronic disease characterized by a decrease in bone density and by a structural deterioration of the bone. This leads to decreased bone resistance and increased risk of fractures, likely generating physical incapacity and dependence on third parties. Estrogen withdrawal that occurs in women after menopause increases bone fragility. Osteoporosis is thus a major health concern for post-menopausal aging women. The increased bone loss rate seen in postmenopausal women results from an imbalance between bone resorption by osteoclasts and new bone formation by osteoblasts. Since this process is preceded by a decrease in circulating estrogens, this phenomenon may regulate the activity and/or differentiation of bone remodeling cells. Mitochondria play an important role in cellular function in osteoblasts; however, the interplay between mitochondria, osteoblast physiology, loss of bone mass, and estrogen signaling remains poorly understood. The main goal of this study was to investigate alterations in cellular metabolism during osteoblast differentiation and how estradiol (E2) regulates this process. In order to achieve our objective, we used the MC3T3-E1 cell line as a cellular model and induced cell differentiation into osteoblasts by addition of 50 μg/mL of ascorbic acid and 10 mM of β-glycerophosphate in the presence and absence of estradiol. Our results using the Alizarin Red S assay demonstrated that, under our experimental conditions, MC3T3-E1 cells differentiated into functioning osteoblasts capable of depositing mineralized matrix. However, the osteoblastic markers Osteocalcin and Runx2 did not reveal differences between the undifferentiated control cells and their counterparts differentiated for 48h, as shown by Western Blotting. Additionally, by measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) using the Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer, we measured a decrease in media acidification (an indirect measurement of glycolysis fluxes) and mitochondrial respiration during the early phases of osteoblastic differentiation (24 and 48h). The protein levels of mitochondrial superoxide dismutase (SOD2) were also decreased after 24 and 48 hours of exposure to differentiation conditions. Furthermore, we showed evidences that E2 at a concentration of 10 nM stimulated mineralization in MC3T3-E1 cells, while estrogen deficiency decreased mitochondrial respiration during the early stages of osteoblastic differentiation. SOD2, Sirt3, and TOM20 protein levels were not affected by estrogen deficiency. Also, mtDNA copy number, as determined by qRT-PCR, did not show alterations after differentiation nor when mimicking estrogen deficiency. The antagonists of the estrogen receptors ERα (MPP, 10 nM) and ERβ (PHTPP, 10 nM) were used to study the role of each estrogen receptor on differentiation and mitochondrial performance in osteoblasts. Although the results with estrogen receptors’ antagonists were not conclusive regarding mitochondrial respiration, there was a clear decrease in mineralization when the ERα antagonist was added to the differentiation medium. Mitochondrial network morphology and mitochondrial membrane potential were assessed by fluorescent microscopy using the TMRM dye. The results showed that these parameters were not affected by the treatments with either E2, MPP or PHTPP. Together, our results suggest that estrogen deficiency leads to impaired mitochondrial performance, showing that osteoblast mitochondria are a potential target for therapies in order to prevent and treat osteoporosis.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/87922
Rights: embargoedAccess
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