Effect of Sex on Brain Metabolism and Intracellular Stress in Type 2 Diabetes

Abstract

A Diabetes tipo 2 é uma das maiores emergências a nível da saúde do século XXI, maioritariamente devido à sua crescente prevalência e proporções epidémicas. A diabetes tipo 2 pode conduzir a complicações neurocognitivas e neurológicas (tal como a neurodegeneração, declínio cognitivo e demência), sendo considerada um fator de risco para doenças neurodegenerativas (nomeadamente para a doença de Alzheimer). A diabetes tipo 2 e a doença de Alzheimer partilham numerosas características e mecanismos fisiopatológicos, tais como o comprometimento do metabolismo da glucose e mitocondrial, e a ativação de mecanismos de stress intracelulares. O sexo feminino constitui outro fator de risco para doença de Alzheimer, podendo adicionalmente afetar estes mesmos mecanismos (em especial durante a perimenopausa e menopausa). Como tal, e no seguimento de um estudo recente realizado no nosso laboratório, colocámos a hipótese de que o sexo afeta diferencialmente a função metabólica, a ativação de mecanismos de stress intracelular cerebrais na diabetes tipo 2 e, consequentemente, a suscetibilidade para a doença de Alzheimer durante a meia-idade. Deste modo, no presente estudo pretendemos analisar os mecanismos moleculares envolvidos nas alterações mediadas pelo sexo no metabolismo energético e mecanismos de stress nitrosativo intracelular no córtex cerebral em condições de diabetes tipo 2, durante a meia-idade. Para tal, utilizámos homogeneizados de córtices cerebrais de ratos de meia-idade (8 meses, ex-reprodutores), do sexo masculino e feminino, das estirpes Wistar (controlos) e Goto-Kakizaki (modelo animal de diabetes tipo 2 espontânea e não obesa), com vista à determinação de marcadores-chave do metabolismo cerebral (nomeadamente vias metabólicas relacionadas com a glucose, mitocôndria e corpos cetónicos) e de stress nitrosativo. Estes parâmetros foram medidos através de técnicas de immunoblotting, reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC), colorimetria, fluorimetria e ELISA.Do ponto de vista periférico, os ratos diabéticos tipo 2 GK do sexo feminino de meia-idade parecem encontrar-se numa fase inicial da doença, enquanto os respetivos machos ainda se encontram numa fase pré-diabética. Apesar da maior densidade do transportador de glucose-3 (GLUT3) no córtex cerebral de ambas as fêmeas de ratos controlo e diabéticos tipo 2, a tomada de glucose da periferia para o cérebro poderá estar comprometida e, desta forma, contribuir para a inibição da glicólise e da fase inicial do ciclo de Krebs cerebral nestes animais. Embora tal não tenha sido acompanhado por um desvio da glucose-6-fosfato para a via das pentoses fosfato, ambos os grupos experimentais de ratos do sexo feminino desenvolveram mecanismos de compensação em diferentes fases do ciclo de Krebs comparativamente aos respetivos machos. Apesar disto, os animais diabéticos tipo 2 do sexo feminino apresentaram uma inibição generalizada da cadeia respiratória mitocondrial sem que tal afetasse os seus níveis cerebrais de ATP, muito provavelmente devido à estimulação do sistema fosfocreatina/creatina cinase. Os perfis cerebrais de corpos cetónicos eram diferentes em ambos os grupos de ratos do sexo feminino, o que sugere um metabolismo divergente destas fontes alternativas de energia. Contudo, estes metabolitos podem também não estar a ser utilizados pelo ciclo de Krebs para produzir energia, uma vez que a fase do ciclo na qual eles poderiam entrar se encontrava atenuada nos cérebros de ambos os grupos de ratos do sexo feminino. Apesar de no nosso estudo anterior os ratos do sexo feminino de meia-idade parecerem mais protegidos contra a acumulação cerebral de marcadores de dano oxidativo e da doença de Alzheimer, no presente estudo os animais diabéticos tipo 2 do sexo feminino poderão estar mais vulneráveis ao stress nitrosativo que os respetivos machos.Em suma, estes resultados reforçam a hipótese de que a atenuação do metabolismo energético/mitocondrial no cérebro de ratos do sexo feminino, controlos e diabéticos tipo 2, de meia-idade, poderá diminuir a sua suscetibilidade à lesão oxidativa e à doença de Alzheimer. Nesta perspetiva, este estudo enfatiza a necessidade de estabelecer estratégias preventivas e/ou terapêuticas adequadas a cada sexo e fase da vida contra a diabetes tipo 2 e suas complicações crónicas ao nível do sistema nervoso central (nomeadamente o défice cognitivo e a doença de Alzheimer).

Type 2 diabetes constitutes one of the largest health emergencies of the 21st century, mostly due to its epidemic proportions and increasing prevalence. Type 2 diabetes may lead to neurocognitive and neurologic complications (such as neurodegeneration, cognitive impairment and dementia), being considered a risk factor for neurodegenerative disorders (including Alzheimer’s disease). Type 2 diabetes and Alzheimer’s disease share several pathological features and pathophysiological mechanisms, namely glucose dysmetabolism, mitochondrial dysfunction and activation of intracellular stress mechanisms. Together with aging, female sex is another risk factor for Alzheimer’s disease and may itself affect the same mechanisms (especially during perimenopause and menopause). Following a recent study from our lab, we hypothesized that sex differently affects type 2 diabetic brain metabolic function, intracellular stress mechanisms and ultimately the susceptibility to Alzheimer’s disease-like pathophysiology at midlife. Thus, in the present study we aimed to analyze the molecular mechanisms involved in sex-mediated changes in type 2 diabetic brain cortical energy metabolism and intracellular nitrosative stress at midlife. As such, we used brain cortical homogenates from middle-aged (8-month-old, retired breeders) male and female Wistar and non-obese, spontaneously type 2 diabetic Goto-Kakizaki (GK) rats to determine key markers for both brain cortical metabolism (glucose-, mitochondria- and ketone bodies-related) and nitrosative stress, by immunoblotting, reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC), colorimetric, fluorimetric and ELISA techniques.Peripheral characterization showed that middle-aged GK female rats were at an early stage of type 2 diabetes, while age-matched GK rat males were still under a pre-diabetic stage. Despite increased brain cortical glucose transporter-3 isoform (GLUT3) density in both control and type 2 diabetic female rats, their glucose uptake towards the brain might be compromised, thereby attenuating their glycolysis and initial stages of Krebs cycle. Though this was not accompanied by a shift of glucose-6-phosphate towards pentose phosphate pathway, both female rat cohorts exhibited compensatory mechanisms at different stages of Krebs cycle compared to the respective male rats. Strikingly, type 2 diabetic female rats showed an overall inhibition of mitochondrial respiratory chain that, nonetheless, did not affect their brain ATP pool – this was most likely due to a stimulation of their phosphocreatine/creatine kinase system. Brain cortical ketone bodies levels profiles were different in both female rat cohorts, suggesting a divergent metabolism of these alternative fuels. However, ketone bodies may not be used by Krebs cycle to produce energy, since the stage of the cycle whereby they could enter is attenuated in both control and type 2 diabetic female rat brains. Despite the protection against Alzheimer’s disease-like and oxidative damage hallmarks described in our previous study, type 2 diabetic female rat brains may be more vulnerable to nitrosative stress than their respective males. Collectively, these results reinforce the hypothesis that the slowdown of brain energy metabolism in middle-aged control and type 2 diabetic female rats may render them less susceptible to such oxidative damage and Alzheimer’s disease-like neuropathology. In this perspective, this study further supports the need to establish sex- and age-specific preventive and/or therapeutic strategies (gender-based Medicine) against chronic type 2 diabetes and its long-term complications affecting the central nervous system (namely cognitive deficits and Alzheimer’s disease).