Understanding the Genetic Program of Conventional Dendritic Cells Type 2 with Direct Cell Reprogramming

Abstract

As células dendríticas (DCs) constituem uma linhagem de células sanguíneas notavelmente heterogénea e são responsáveis por interligar as repostas imunitárias inata e adquirida. As células dendríticas convencionais (cDCs) funcionam como células apresentadoras de antigénios (APCs) profissionais ao apresentarem os antigénios por elas captados a linfócitos T imaturos podendo ser divididas em dois grandes subgrupos: cDCs tipo 1 e tipo 2. Enquanto as cDC1 realizam principalmente apresentação cruzada de antigénios e estimulam linfócitos T CD8+ citotóxicos, as cDC2 são especializadas em apresentação pelo complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II) levando à polarização em diferentes tipos de linfócitos T CD4+ auxiliares e linfócitos T reguladores. Algumas cDC2 controlam respostas imunitárias do tipo 2 contra parasitas enquanto outras detectam bactérias extracelulares e iniciam respostas do tipo 3. Em parte devido à sua grande heterogeneidade quando comparadas com outras DCs, o programa genético subjacente ao desenvolvimento das cDC2 e à sua diversidade é ainda pouco claro. As estratégias de reprogramação epigenética permitem a indução de uma célula somática directamente noutros tipos celulares. Através da sobre-expressão de combinações de factores de transcrição (TFs), esta estratégia é já bastante aplicada na geração de vários tipos celulares em contextos de medicina regenerativa. Recentemente, a reprogramação de fibroblastos em células apresentadoras de antigénios semelhantes a cDC1 foi provada através da expressão de PU.1, IRF8 e BATF3, abrindo portas à modulação de respostas imunitárias através da reprogramação celular. Neste estudo, esta estratégia de combinação de TFs foi modificada de modo a induzir a diversidade da linhagem cDC2 e desvendar os mecanismos geradores de heterogeneidade destas células. Os TFs PU.1 e IRF4 mostraram-se ser cruciais para o desenvolvimento de cDC2 mas não suficientes para induzir reprogramação. Um grupo adicional de 33 TFs candidatos para induzir estádios cDC2 foi identificado através de pesquisa de literatura e análise bioinformática. Os TFs candidatos foram clonados em vectores de expressão lentiviral indutivos e testados em fibroblastos de embrião de murganho (MEFs) Clec9a-tdTomato e Zbtb46-GFP, repórteres de DCs. Adicionalmente foram também validados alguns marcadores superficiais de cDC2 por análise de células do baço, posteriormente usados para confirmar a reprogramação em cDC2. Várias combinações de TFs mostraram ser capazes de activar os repórteres Clec9a e Zbtb46 e a expressão de marcadores de superfície. Os TFs PU.1, IRF4 e TF18 aumentaram significativamente a activação dos repórteres, expressão de CD11b e a indução de células duplas positivas tdT+CD11b+ e tdT+Sirpα+. Esta combinação mostrou também induzir a expressão de CD45 e MHC-II, sugerindo a aquisição de competência para apresentação de antigénios. Os TFs TF9 e TF17 quando adicionados aos PU.1 e IRF4 resultaram também em activação de repórter e expressão de marcadores embora não actuando sinergicamente com o efeito do TF18, sugerindo, portanto, a indução de diferentes cDC2. Globalmente, várias combinações de TFs foram aqui identificadas para reprogramação em cDC2. Estes resultados abrem possibilidades para uma melhor compreensão da diversidade das cDC2 e oferecem uma plataforma para a futura geração de cDC2 específicas para pacientes num contexto de imunoterapia.

Dendritic cells (DCs) constitute a remarkable heterogeneous blood lineage responsible for linking innate and adaptive immune responses. Conventional DCs (cDCs) function as professional antigen-presenting cells (APCs) by presenting captured antigens to naïve T cells and can be further divided into two major subsets: cDC type 1 (cDC1) and type 2 (cDC2). While cDC1 mainly perform antigen cross-presentation and cytotoxic CD8+ T cell priming, cDC2 are specialized in major histocompatibility complex class II (MHC-II) presentation, leading polarization towards different CD4+ helper or regulatory T cell phenotypes. Some cDC2s govern type 2 immune responses against parasites and others sense extracellular bacteria and initiate type 3 immunity. Partly due to their high heterogeneity when comparing with other DC subsets, the genetic program underlying cDC2 cell fate determination and diversity remains unclear. Epigenetic reprogramming strategies allow the induction of a somatic cell directly into different cell types. By overexpression of transcription factor (TF) combinations, this strategy is already vastly applied to the generation of multiple cell types in the context of regenerative medicine. Recently, reprogramming of fibroblasts into cDC1-like induced APCs was proven by the expression of PU.1, IRF8 and BATF3, paving the way to modulate immune responses with cell reprogramming. Here, this combinatorial TF strategy was modified to induce cDC2 lineage diversity and unravel the genetic drivers of cDC2 heterogeneity. PU.1 and IRF4 were shown to be crucial in cDC2 development but not sufficient for cDC2 reprogramming. An additional set of 33 candidate TFs to induce cDC2 cell states was identified by combining literature and bioinformatic analysis. Candidate TFs were cloned into inducible lentiviral expression vectors and were tested in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) bearing the Clec9a-tdTomato and Zbtb46-GFP DC-reporter systems. Additional surface markers for the cDC2 lineage were validated by analysis of splenocytes and used to further confirm cDC2 reprogramming. Several combinations of TFs were shown to differentially activate the Clec9a and Zbtb46 reporters and surface marker expression. PU.1, IRF4 and TF18 dramatically increased reporters’ activation, CD11b expression and induced tdT+CD11b+ and tdT+Sirpα+ double positive cells. This combination also shown to induce CD45 and MHC-II expression, suggesting acquisition of competence for antigen presentation. TF9, and TF17 addition to PU.1 and IRF4 also resulted in reporter activation and surface marker expression although not synergistically enhancing TF18’s effect, therefore suggesting a differential cDC2 cell fate induction. Overall, several TF combinations were identified for cDC2 reprogramming. These results open new possibilities for a better understanding of the diversity of cDC2 specification and provide a platform for generating patient-tailored reprogrammed cDC2 for immunotherapy.