Time-Gated Fluorescence Lifetime Microscopy Methods and Instrumentation for Metabolic Imaging

Abstract

Time-Gated fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is a microscopy technique where fluorescence decay curves are acquired by opening a series of time windows delayed from the excitation pulse. The analysis of these fluorescence decays results in images where the pixel value is a fluorescence lifetime. This technique has a wide range of applications, including biological and biomedical functional imaging. Metabolic imaging, where the images are obtained from the autofluorescence of metabolic coenzymes and correspond to maps of cell metabolism, is an example. In this project, we develop a wide-field Time-Gated fluorescence lifetime microscope suitable for one-photon excitation of FAD fluorescence and evaluated its performance and its suitability to metabolic imaging of thick biological samples such as the cornea. The project also included the evaluation of Structured Illumination Microscopy (SIM) methods for optical sectioning and the assessment of the accuracy and precision limits of the Rapid Lifetime Determination (RLD) algorithms that compute the decay parameters and the ratio used as metabolic indicator. This was done through computer simulations on a model of the time-gated microscope, with accurate noise modelling and accounting for the measured instruments response function (IRF), in conditions imposed by in vivo imaging acquisition (total counts lower than 104, no frame summing). Throughout this report, we show the developed instrument has timing and optical performance comparable to similar implementations found in the literature and complies with the requirements to measure FAD emission in cells. We successfully implemented SIM in the instrument, obtaining the desired out-of-focus background rejection with well-known test samples. We also verified that the SIM techniques did not affect the accuracy of the measured lifetime but degraded their precision. The evaluation of the RLD performance defined an optimal region for FAD fluorescence lifetime accuracy and precision: gate separations around 1800 ps and low camera gains (1.05 or 2.41). In this region, the accuracy of the shorter lifetime (τ1) is always better than 10% but the precision error is near 20%. For the longer lifetime (τ2) both the accuracy and the precision errors are smaller (< 5% and <10%, respectively). The accuracy of the fractional contributions α1 and α2 and of the metabolic ratio α2/α1 remains rather stable for gains k’≤2.41 and gate separations Δt>1000 ps, with a ratio accuracy error around 15%. However, the ratio precision is always worse than 10%. Our results also demonstrate that both the accuracy and the precision associated to the metabolic ratio not only depend on the adopted windowing scheme, but also on the nominal value of the ratio: higher values of metabolic ratio will have worse precision and better accuracy. Moreover, no gate separation offers measurement performance independent of the ratio value being measured, although, for any ratio value, its precision is stable for gate separations between 1500 and 2500 ps. Applications where the range of expected ratio values lies between 0.25 and 1.22 yield a precision error between 13.5% and 25%. A new version of RLD algorithm for single-exponential decays is presented. This version accounts for the effect of the IRF of the microscope in the measurement accuracy by deconvoluting the IRF from the acquired data. The algorithm uses an iterative reconvolution scheme and results in large improvements of lifetime accuracy for short lifetimes. Concerning the application to whole cornea imaging, we conclude that the techniques used in the time-gated microscope are unable to obtain cell metabolic images based on FAD fluorescence decays. SIM optical sectioning is extremely challenging on this type of sample due to their large thickness and transparent nature that prevent an adequate contrast of the structured pattern projected in the sample. This made impossible to obtain effective optical sections of corneal layers and cell structures. We were able to acquire fluorescence images from epithelial and endothelial cells, but, due to the lack of optical sectioning, the contributions from the out-of-focus layers degraded considerable the image quality. In conclusion, the wide-field one-photon excitation approach to FAD fluorescence lifetime metabolic microscopy of the cornea is not viable. Despite this negative outcome, this work resulted in a fully functional time gated fluorescence lifetime microscope and allowed to test the limits of the RLD algorithms in the demanding conditions of low count images as well as to accomplish a thorough evaluation of the performance of time-gate fluorescence lifetime microscopy in the imaging of thick transparent samples.

A microscopia de tempo-de-vida de fluorescência Time-Gated é uma técnica de microscopia onde as curvas de decaimento de fluorescência são adquiridas através da abertura de uma série de janelas temporais (gates)com um determinado atraso em relação ao pulso de excitação. A análise destas curvas de fluorescência resulta em imagens cujos valores dos pixéis são tempos de vida de fluorescência. Existe uma grande variedade de aplicações para esta técnica, incluindo imagiologia funcional em aplicações biológicas e biomédicas. Um exemplo é a imagiologia metabólica, técnica onde as imagens são obtidas através do sinal de autofluorescência proveniente de coenzimas metabólicas e correspondem ao metabolismo da célula. Neste projecto, um microscópio de tempo de vida de fluorescência Time-Gated de campo inteiro com excitação por um fotão da fluorescência do FAD foi desenvolvido e o seu desempenho e aplicabilidade em imagiologia metabólica de amostras biológicas espessas como a córnea foi avaliado. Técnicas de microscopia de iluminação estruturada (SIM) foram implementadas e avaliadas, bem como uma análise dos limites de exactidão e precisão dos algoritmos de determinação rápida do tempo-de-vida (RLD), que calculam os parâmetros do decaimento e o rácio usado como indicador metabólico. Esta análise foi feita através de simulações computacionais do modelo de aquisição do microscópio Time-Gated com um modelo de ruído exacto e tendo em conta as medidas da função de resposta do instrumento (IRF) nas condições impostas pelas aquisições de imagens in vivo (número de contagens de fotões total inferior a 104 sem soma de frames). Ao longo deste documento, demonstramos que o instrumento desenvolvido apresenta performances óptica e temporal comparáveis com outras implementações semelhantes descritas na literatura, e está em conformidade com os requisitos necessários para medir a emissão de fluorescência do FAD nas células. A técnicas de SIM foram implementadas com sucesso, conseguindo atingir a supressão do fundo fora de foco desejada em amostras de testes bem conhecidas. Também verificámos que estas técnicas de iluminação estruturada não afectam a exactidão das medidas de tempo-de-vida, mas degradam a sua precisão. A avaliação da performance do RLD definiu uma região óptima para a exactidão e precisão do tempo-de-vida de fluorescência do FAD: separações entre gates de 1800 ps e baixos ganhos na câmara (1.05 ou 2.41). Nesta região a exactidão do tempo-de-vida mais curto (τ1) é sempre melhor que 10%, mas o erro de precisão está perto de 20%. Para o tempo de vida mais longo (τ2) tanto os erros de exactidão como de precisão são mais baixos (< 5% e <10%, respectivamente). A exactidão nas contribuições fraccionais α1 e α2 e do rácio metabólico α2/α1 mantém-se estável para ganhos k’≤2.41 e para separações de gate Δt>1000 ps, com um erro de exactidão no rácio próximo de 15%. No entanto, a precisão no rácio é sempre pior que 10%. Os nossos resultados demonstram que tanto a exactidão como a precisão associadas ao rácio metabólico não dependem apenas do esquema de gate adoptado, mas também no valor nominal do próprio rácio: valores mais altos de rácio metabólico têm piores precisões e melhores exactidões. Além disso, não existe um valor de separação de gate que ofereça medidas de performance independentes do valor do rácio a ser medido, mesmo que, para qualquer valor de rácio, a precisão seja estável para separações de gate entre 1500 e 2500 ps. Para aplicações onde os valores esperados do rácio variêm entre 0.25 e 1.22, o erro de precisão está entre 13.5% e 25%. Uma nova versão do algoritmo de RLD para decaimentos mono-exponenciais é apresentada. Esta versão tem em conta o efeito da IRF do microscópio na medida da exactidão, através da sua desconvolução nas medidas adquiridas. O algoritmo usa um esquema de reconvolução iterativo, o que resulta em fortes melhorias na exactidão de medidas de tempos-de-vida curtos. Em relação às aplicações para imagiologia de córneas inteiras, concluiu-se que as técnicas usadas no microscópio time-gated não são capazes de obter imagens metabólicas baseadas nos decaimentos de fluorescência do FAD. O seccionamento óptico através de SIM é bastante difícil neste tipo de amostra, uma vez que a sua espessura e transparência impedem a obtenção de um contraste do padrão projectado na amostra adequado. Isto fez com que fosse impossível obter secções ópticas efectivas das camadas da córnea e das suas estruturas. Foram adquiridas algumas imagens de fluorescência das células do epitélio e do endotélio, mas, devido à falta de seccionamento óptico, as contribuições das camadas fora de foco deterioraram consideravelmente a qualidade da imagem. Para concluir, usar microscopia de campo inteiro através de excitação por um fotão para imagiologia metabólica baseado em FAD na córnea não é uma solução viável. Apesar disso, deste trabalho resultou um microscópio de tempo de vida de fluorescência time-gated completamente funcional que permitiu testar os limites dos algoritmos RLD em condições difíceis de baixo número de contagens. Mais ainda, também foi possível conseguir uma avaliação extensa da sua performance em imagiologia de amostras espessas e transparentes.