Insights into gold nanoparticles functionalized with cysteine-terminated cecropin melittin and cathelicidin-derived antimicrobial peptides - a computational approach

Abstract

Despite the remarkable development of antimicrobial drugs during the past decades, in-fectious diseases remain the second-leading cause of death worldwide. Antimicrobialpeptides (AMPs) are a class of antimicrobials that are known to hinder the antimicro-bial resistance and are very effective against several strains of bacteria, fungi and viruses.However, these materials lack bloodstream stability and targeting capabilities, which hasmotivated the search for nanomaterials to be used as carriers. The immobilization of goldnanoparticles (AuNPs) with AMPs appeared as a new and promising way to enhance bothactivity and targeting capabilities of AMPs. Nonetheless, the investigation of these sys-tems on how they function at the nanoscale is scarcely reported. In this context, Molecularmodelling and simulation tools are crucial to address issues which are extremely difficult,or even impossible, to be addressed experimentally.This work aimed at gaining new insights into gold nanoparticles functionalized withtwo types of cysteine-terminated antimicrobial peptides – a cecropin melittin hybrid anda cathelicidin-derived peptide – from a computational approach. In line with this objec-tive a molecular dynamics based study was carried out to probe the targeted systems atnanoscale in three vectors: i) adsorption capability of the AMPs onto gold surfaces; ii)free-energy characterization of the AMP/AuNP conjugate interaction using an advancedsampling method; iii) assessment of the interaction of a AMP/AuNP conjugate with abiomembrane mimetic model.The obtained results show that the way the peptides approach the surface dictates thefinal conformation and the time required to achieve it. The AMP diffusion process is af-fected by the attraction field projected by the gold surface into the solvent, resembling aexponential decay. It was possible to identify a high affinity between the AMPs and thegold surface, characterized by the direct contact between theα-carbon protons and thesurface. Furthermore, it is demonstrated that cysteine (CYS) promotes a faster conforma-tional stabilization during the lockdown regime of the CYS-terminated AMPs, noticeablyaffecting this by acting as a preferential anchoring point.The structural analysis combined with the free energy surface (FES) characterizationallowed to assess the role of CYS residue during the formation of the conjugate, and,more significantly, has helped to understand how the AuNP contributes to improve theantimicrobial activity of the peptide. It was found that CYS promotes a lower confor-mational entropy (before and after adsorption onto the AuNP) and a faster adsorptionprocess when compared to the AMP without CYS. The presence of the AuNP fosters theelongation of the peptides along with the adsorption, which translates into the increase ofthe solvent accessible surface area. This elongation, combined with the greater availability of positively charged residues upon adsorption, provide a rationale for the enhancementof the activity of AMP/AuNP conjugates.The simulation of the interaction between the cathelicidin-derived peptide conjugateand the lipid bilayer model allowed to unveil the effect of each component on the bilayercharacteristics. The bare AuNP causes a severe deformation in the bilayer leaflets, moti-vated by the displacement of the lipid molecules. The fact that the lipids are adsorbingto the AuNP by displacing the water on its surface suggests an adsorption mechanismsimilar to that for AMPs. Oppositely, the conjugate tends to migrate to the bilayer sur-face without penetrating in it, thus causing minor disturbances in the bilayer properties.The AuNP corona formed by the AMP shields the AuNP from lipids, precluding its per-meation in the bilayer. Similarly to the conjugate, the free AMPs consistently migrate tothe bilayer surface. The AMP residues with hydrophobic side-chains eventually orientthemselves to the bilayer center, hampering its release to the solvent.It is believed that the wealth of data provided by this work contributes to a betterunderstanding of the conjugate formation of cecropin melittin and cathelicidin-derivedAMPs with AuNPs, and constitutes a solid starting point for more in-depth studies on themechanisms that govern the interactions of these conjugates with cell membranes.

Apesar do extraordinário desenvolvimento dos medicamentos antimicrobianos, as doençasinfecciosas continuam a ser a segunda maior causa de mortalidade a nível mundial. Ospéptidos antimicrobianos (PAM) são uma classe de agentes antimicrobianos aptos a fazerface à resistência antimicrobiana, com actividade contra diferentes estirpes de bactérias,fungos e vírus. Contudo, possuem baixa estabilidade na corrente sanguínea e fraca ca-pacidade de visar o agente patógeno pretendido. Estas limitações levaram à pesquisa edesenvolvimento de materiais nanoestruturados para serem utilizados como suporte, e,neste âmbito, a conjugação de nanopartículas de ouro (AuNP) com PAM emergiu comouma estratégia promissora no sentido de melhorar a actividade e o efeito dirigido sobreos patógenos. A investigação experimental deste tipo de sistemas à nanoescala é escassa,difícil, ou mesmo inexequível, pelo que o recurso a ferramentas de modelação e simulaçãocomputacional revela-se determinante no estudo fundamental de fenómenos cujo acessopor via exclusivamente empírica é uma impossibilidade.Este trabalho teve por finalidade resolver, mediante uma abordagem computacional,pormenores fundamentais sobre sistemas baseados em nanopartículas funcionalizadascom péptidos antimicrobianos (híbrido de cecropina e melitina e um derivado da cateli-cidina). Para o efeito, recorreu-se a ferramentas de dinâmica molecular para explorar ossistemas objecto de estudo em três vertentes: i) capacidade de adsorção dos PAM emsuperfícies de ouro; ii) caracterização da superfície de energia livre da formação do conju-gado PAM/AuNP recorrendo a métodos de dinâmica molecular convencionais e avança-dos; iii) avaliação da interação do conjugado do derivado da catelicidina com um modelode biomembrana.Os resultados obtidos indicam que a orientação do péptido na sua aproximação àsuperfície dita a sua conformação final, bem como o tempo necessário para a atingir. Oprocesso de difusão dos PAM é afectado pelo campo de atracção projectado pela AuNP nosolvente, resultando em um perfil semelhante a um decaimento exponencial. Os PAM e asuperfície revelam grande afinidade, caracterizada pelo contacto directo entre os protõesdos carbonos-αe a superfície. Adicionalmente, foi demonstrado que a presença da cisteína(CYS) acelera a estabilização do PAM durante o regime de ajuste à superfície, sendo queeste resíduo actua como um ponto ancoragem no ouro.A análise estrutural e a caracterização da superfície de energia livre permitiram, porum lado, avaliar o efeito da cisteína durante o processo de formação do conjugado, e, poroutro, não menos importante, ajudar a perceber como é que a AuNP afecta a actividadedos PAM. Verifica-se que a CYS promove uma entropia conformacional inferior (antes edepois da adsorção) e parece catalisar o processo de adsorção. A presença da AuNP no sistema leva a que os PAM se apresentem preferencialmente alongados após a adsorção, oque se traduz numa a ́rea de acesso de solvente superior. Este elongamento e o facto de osPAM terem os resíduos com carga posítiva mais disponíveis ajudam a explicar o aumentode actividade dos conjugados.A simulação da interacção do conjugado do derivado da catelicidina com o modelode biomembrana permitiu avaliar o efeito de cada componente nas características dessabicamada lipídica. Os resultados mostram que a AuNP sem PAM provoca severas defor-mações na superfície da biomembrana, promovida por uma forte interacção com os lípidosconstituintes. O facto de os lípidos aderirem à superfície da AuNP por deslocalização dasmoléculas de água na sua uperfície sugere que o mecanismo de adsorção é similar ao dosPAM na AuNP. Contrariamente, e apesar de migrar para a superfície, o conjugado nãoprovoca deformações na biomembrana. De facto, o revestimento de PAM do conjugadoactua como um agente protector da AuNP, não permitindo a sua permeação. De formasemelhante, os PAM livres migram consistentemente para a superfície da biomembrana,tendendo a manter-se nessa condição. Esta comportamento com a biomembrana é moti-vado pela orientação dos resíduos hidrofóbicos para o interior da membrana, actuandocomo uma âncora.Em suma, confia-se que o conjunto de dados originais reunidos neste trabalho é umacontribuição importante para melhor compreender, de um ponto de vista fundamental,a formação e as características essenciais de conjugados de cecropia e do derivado decatelicidina com AuNP, e constitui um ponto de partida relevante na avaliação detalhadados mecanismos prevalecentes na sua interacção com membranas celulares.