Permeability through Caco-2 cell monolayers as a model for BBB: implementation and preliminary evaluation using model compounds

Abstract

In early stages of drug discovery, the capacity of a compound to cross biological membranes is a determining factor in the selection of drug candidates. This is very important in the case of orally administered drugs once they must be absorbed at the gastrointestinal tract in order to reach the target of interest. Compounds targeted to the central nervous system have also to overcome the blood-brain barrier (BBB), which imposes even more constraints on the drug properties.In general, passive permeation is the major route for the intake of drugs across cell membranes, as they are usually not recognized by specific transporters. Additionally, drugs may be substrates of active efflux pumps such as P-glycoprotein, which further limits their effective permeation towards the target tissue/receptor.The use of in vitro models to mimic biological barriers is of extreme importance to evaluate drug‟s bioavailability. The human colon carcinoma cell line Caco-2 is a well characterized in vitro model of the intestinal epithelium for prediction of intestinal drug permeability and oral drug absorption in humans. This model has been thoroughly used by the scientific community and has delivered a large amount of data. Unfortunately, the discrepancy between the permeability coefficients reported by different research groups is very large, often differing by several orders of magnitude. This precludes the use of this information to obtain Quantitative Structure Property Relationships (QSPR) that may be reliably applied to predict drug‟s bioavailability in cells and tissues. Those discrepancies may come from several sources, namely the cell passage number or the experimental conditions used in the permeability assay (particularly the composition of the transport media).In this work we implement in vitro permeability assays using the Caco-2 cell model, for several model drugs. The effect of the presence of serum albumin in the donor/receiver compartment was quantitatively evaluated and rationalized in terms of the free fraction of drug. The apparent permeability coefficient was interpreted taking into account the drug‟s interaction with components of the transport media as well as with the cell membranes, using the kinetic model recently developed in our group.The ultimate goal of this study is the establishment of QSPR, with a view to understand and predict the rate of drug permeation through cell monolayers such as the BBB. With this objective, permeability assays using endothelial cells obtained from Hematopoietic Stem Cells, have been undertaken. Comparison between the results obtained with the two distinct cell models allows a better characterization of the properties of the different biological barriers, and an optimization of the drug‟s properties depending on their target tissue.

Nas fases iniciais do desenvolvimento de fármacos, a capacidade que o composto tem de atravessar as membranas biológicas é um factor determinante na selecção de candidatos a fármaco. Este processo é particularmente relevante no caso de fármacos administrados por via oral, uma vez que estes têm de ser absorvidos ao nível do tracto gastrointestinal para atingirem o alvo de interesse. Compostos direccionados ao sistema nervoso central tem adicionalmente de atravessar a barreira hematoencefálica (BHE), que por sua vez impõe mais restrições às propriedades do fármaco.De uma forma geral, os fármacos permeiam as membranas celulares por processos passivos, uma vez que não são reconhecidos por transportadores específicos. Adicionalmente, os fármacos podem ser substratos de transportadores de efluxo, tais como a glicoproteína-P, o que limita a sua permeação passiva em direcção ao tecido/receptor alvo.O uso de modelos in vitro que mimetizam as membranas biológicas é de extrema importância para avaliar a biodisponibilidade de um fármaco. A linha celular de adenocarcinoma do cólon humano (Caco-2) é um modelo in vitro bem caracterizado do epitélio intestinal, usado para prever a permeabilidade intestinal de fármacos e a sua absorção oral em humanos. Este modelo tem sido extensivamente usado pela comunidade científica dando origem a uma grande quantidade de dados. Infelizmente, a discrepância entre os coeficientes de permeabilidade reportados por diferentes grupos de investigação é enorme, muitas vezes diferindo em várias ordens de grandeza. Isto impede a sua utilização para a obtenção de relações quantitativas estrutura-propriedade (QSRPs) que possam ser aplicadas para prever a biodisponibilidade de fármacos nas células e tecidos. Estas discrepâncias podem surgir de várias fontes, nomeadamente do número de passagem das células ou das condições experimentas usadas no ensaio de permeabilidade (particularmente a composição do meio de transporte).Neste trabalho, implementaram-se ensaios de permeabilidade in vitro usando o modelo Caco-2 para vários compostos. O efeito da presença de albumina nos compartimentos dador/aceitante foi quantitativamente avaliada e racionalizada em termos da fracção de composto livre. Os coeficientes de permeabilidade aparente foram interpretados tendo em conta a interacção do composto com os componentes do meio de transporte bem como com as membranas das células, usando um modelo cinético desenvolvido no grupo.O objectivo último deste trabalho é o estabelecimento de QSRPs com vista a entender e prever a velocidade de permeação através de monocamadas de células, tais como a BHE. Com este objectivo, foram realizados ensaios de permeabilidade em células endoteliais obtidas a partir de células estaminais hematopoéticas. A comparação entre os resultados obtidos nos dois modelos celulares permitirá uma melhor caracterização das propriedades das diferentes membranas biológicas, e uma optimização das propriedades do fármaco tendo em conta o seu tecido alvo.