Multiplexed CRISPR activation of neuroprotective genes for Alzheimer's Disease

Abstract

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa devastadora cuja prevalência tem vindo a aumentar nos países desenvolvidos. Apesar de existirem terapias aprovadas, estas baseiam-se no tratamento dos sintomas e consequentemente há a necessidade de estabelecer tratamentos preventivos ou capazes de impedir a progressão da doença. Dada a complexidade e heterogeneidade da doença de Alzheimer, existem múltiplos mecanismos patológicos que contribuem para a progressão da doença, incluindo a deposição de β-amilóide (βA) e tau hiper-fosforilada (TauHF). No entanto, as terapias propostas têm-se focado em alvos terapêuticos individuais da doença, o que poderá estar a limitar a eficácia terapêutica e a descoberta de terapias eficientes. Desta forma, o tratamento simultâneo de múltiplos mecanismos patogénicos da doença deverá aumentar a eficácia terapêutica contribuindo para um maior êxito na descoberta de novas terapias.O estabelecimento da tecnologia de ativação mediada por CRISPR (CRISPRa) facilitou a ativação da transcrição de vários genes em simultâneo. Por sua vez, a tecnologia CRISPRa permite a definição de terapias que visam atuar em múltiplos aspetos da doença de Alzheimer. Ao mesmo tempo, a entrega de transgenes in vivo via rAAV tem demonstrado resultados promissores. Desta forma, neste projeto é proposto uma terapia génica complexa envolvendo a ativação de três genes (ADAM9, ADAM17 e TFEB) mediada por um sistema ativador CRISPR miniaturizado que é entregue através de um sistema duplo de rAAV.ADAM9 e ADAM17 participam na via não-amiloidogénica do processamento de APP, prevenindo a formação de βA e promovendo a produção de um peptídeo secretado neurotrófico demonimado sAAPα. Relativamente ao gene TFEB, o produto da sua transcrição é um fator de transcrição que controla positivamente a expressão de inúmeros genes lisossomais. Quando sobreexpresso, TFEB ativa a via lisosomal/autofágica e intensifica a degradação intracelular de espécies patológicas de βA e de TauHF.Nesta tese foi desenvolvido um sistema simples, rápido e flexível baseado na medição de fluorescência para escolha de sgRNA(s) que permitam a atividade máxima do ativador CRISPR. Em paralelo, o ativador CRISPR miniaturizado foi modificado de forma a melhorar a sua localização nuclear. Por último, foi estabelecida uma estratégia de clonagem para a produção de plasmídeos que expressam múltiplos sgRNAs, os quais serão necessários para a ativação simultânea da transcrição dos genes neuroprotetores ADAM9, ADAM17 e TFEB.

Alzheimer’s Disease (AD) is a devastating neurodegenerative condition and its prevalence has been increasing in developed societies. Despite the large number of clinical trials testing new treatments for AD, the currently approved drugs focus on improving clinical symptoms. Consequently, there is an urgent need for effective therapies able to stop or prevent the disease progression. Since AD is a highly complex and heterogeneous condition, several pathological mechanisms contribute for its progression, including Aβ and hyperphosphorylated tau (pTau) pathologies. However, all proposed disease-modifying therapies have focused on single aspects of the disease, which may be limiting their therapeutic efficacy. In this manner, the simultaneous targeting of different aspects of the disease may increase the chances for developing effective disease-modifying therapies.The CRISPR-mediated activation (CRISPRa) technology can be used to specifically and simultaneously upregulate multiple endogenous genes, allowing the targeting of distinct aspects of AD. In recent years, recombinant Adeno Associated Viral Vectors (rAAV) have been shown to be a promising delivery vehicle for gene therapy. Thus, in this project it is proposed that a composite gene therapy employing a dual-AAV system for the delivery of a miniaturized CRISPRa system targeting the genes ADAM9, ADAM17 and/or TFEB can be used to treat multiple therapeutic targets in AD.ADAM9 and ADAM17 participate in the non-amyloidogenic processing of APP, preventing the formation of Aβ and promoting the generation of secreted neurotrophic sAAPα peptide. On the other hand, TFEB is a master regulator of multiple lysosomal genes and its upregulation not only enhances the lysosomal/autophagic pathway but has also been shown to improve the clearance of intracellular pathogenic Aβ and pTau.Within the scope of this thesis, a simple, fast and flexible fluorescence-based screening assay was developed to select experimentally optimal promoter-specific sgRNA(s) that enable optimal gene upregulation by CRISPRa. In parallel, the miniaturized CRISPR activator was re-designed to improve nuclear localization for neuronal delivery. Lastly, a cloning strategy for the production of rAAV transfer vector plasmids expressing multiple sgRNAs was established. These three key aspects are required to test the activation of the neuroprotective genes ADAM9, ADAM17 and TFEB.