Contributo da Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo para o diagnóstico das Síndromes Mielodisplásicas

Abstract

Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry (FC) is a technique that has been used for the hematologic neoplasm diagnosis, classification, prognosis and therapy monitoring. In the minimum diagnostic criteria, FC analysis of bone marrow (BM) cells was suggested as a co-criterion for the diagnosis of Myelodysplastic Syndromes (MDS) by the 2016 World Health Organization (WHO) Classification of Myeloid Neoplasms and Acute Leukemia. The molecular and cytogenetic techniques sensitivity and specificity, especially fluorescence in situ hybridization (FISH), used in MDS diagnosis, can be improved by FC mediated cell sorting. Despite its several advantages, FC immunophenotyping still faces several limitations in the contribution to the MDS diagnosis, namely the reduced knowledge about the erythroid maturation in normal MO and the lack of erythroid characterization markers, which makes the study of associated dysplasia less sensitive. The diagnostic panel for B-cell Chronic Lymphoproliferative Disorder (B-CLPD) includes markers whose expression shown to be altered in the erythroid lineage of MDS cases, namely CD43 and CD49d.This work consisted of two major objectives. The first consisted on the separation of the cells from the monocytic, granulocytic (neutrophilic) an erythroid lineages and the (CD34+/-/CD117+) cells from the BM of 55 cases with suspected MDS (71 ± 12 years), corresponding to 21 women and 34 men, in order to increase the FISH technique sensitivity (32 processed cases) and to detect the incidence of the most frequent genetic alterations in this entity, thus contributing to the diagnosis and prognosis. Chromosomal abnormalities were detected in only 17 processed cases, namely del (20q), monosomy 7, del (7q), del (5q), (-Y), and trisomy 8.The second objective was to study the expression pattern of CD43 and CD49d markers, both included in the diagnostic panel of B-CLPD, in the normal BM CD34+ compartment and in the erythroid maturation, being the latter studied in the normal BM and in MDS diagnosed cases. For this, 31 samples of BM aspirates were evaluated, of which 13 samples from normal BM and 18 samples from patients diagnosed with MDS. The MDS group was divided into MDS I (which includes MDS cases with single lineage dysplasia (n=2) and with multilineage dysplasia (n=6)); MDS II (which includes MDS cases with excess blasts 1 (n=3) and excess blasts 2 (n=7). Also, among all MDS cases (n=18), a third group of MDS with erythroid dysplasia demonstrated by morphology (n=7) was defined.In the CD34+ compartment, the expression of CD43 and CD49d shown to be much higher in the hematopoietic precursors compromised with the erythroid lineage compared to the precursors involved with the other lineages. In normal erythroid maturation, there was a decrease in the expression of CD43 across the different stages, with a high expression in stage I and a consequent decrease until the last stage. The expression pattern of CD49d was characterized by an increase in expression levels from stage I to stage II, by maintained expression between stage II and III and by a constant decrease from stage III to the last stage, which presented the lowest expression of this marker. In the MDS group, the expression of CD43 and CD49d showed to follow the same pattern observed in normal BM, however, a statistically significant decrease in mean fluorescence intensity (MFI) values was observed in all maturation stages for both markers, compared to the control group, particularly in MDS II and MDS with morphologic erythroid dysplasia.The results obtained during this study reinforce the contribution of FC in the MDS diagnosis and point to the usefulness of CD43 and CD49d markers in the erythroid maturation characterization, thus contributing to expand the panel of markers used for the study of this lineage, and since both markers are included in the B-CLPD diagnostic panel, could contribute to the concomitant diagnosis of a chronic B cell disorder and a possible MDS.

A imunofenotipagem por Citometria de Fluxo multiparamétrica (CF) é uma técnica que tem sido utilizada para o diagnóstico, classificação, prognóstico e monitorização da terapêutica de neoplasias hematológicas. Nos critérios mínimos de diagnóstico, a análise de células da medula óssea (MO) por CF foi sugerida como um co-critério para o diagnóstico de Síndromes Mielodisplásicas (SMD) pela Classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) de Neoplasias Mieloides e Leucemia Aguda de 2016. A sensibilidade e especificidade das técnicas moleculares e citogenéticas, principalmente a técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH), utilizada no diagnóstico da SMD, podem ser melhoradas através da separação celular por CF. Apesar das suas várias vantagens, a imunofenotipagem por CF ainda enfrenta várias limitações ao nível da contribuição para o diagnóstico das SMD, nomeadamente o reduzido conhecimento sobre a maturação da linha eritroide, na MO normal e a falta de marcadores para a caracterização desta mesma linha, o que torna o estudo de displasias associadas pouco sensível. O painel de diagnóstico de Doenças Linfoproliferativas Crónicas de células B (DLPC-B) inclui marcadores cuja expressão mostrou ser alterada na linha eritroide em casos de SMD, nomeadamente o CD43 e o CD49d.Este trabalho engloba dois grandes objetivos. O primeiro consistiu na separação das células das linhas granulocítica (neutrófilo), monocítica e eritroide, e das células (CD34+/-/CD117+) da MO de 55 casos com suspeita de SMD (71 ± 12 anos), correspondendo a 21 mulheres e 34 homens, de forma a aumentar a sensibilidade da técnica de FISH (32 casos processados) e detetar a incidência das alterações genéticas mais frequentes nesta entidade, contribuindo desta forma para o diagnóstico e prognóstico. Foram detetadas anormalidades cromossómicas em apenas 17 dos casos processados, nomeadamente a del (20 q), monossomia do 7, del (7q), del (5q), anomalia (-Y), e a trissomia do 8.O segundo objetivo consistiu no estudo do padrão de expressão dos marcadores CD43 e CD49d no compartimento CD34+ da MO normal e na linha eritroide, sendo esta última estudada na MO normal e em casos diagnosticados com SMD. Para isso, foram analisadas 31 amostras de aspirados medulares referentes a 13 amostras de MO normal e 18 amostras de doentes com diagnóstico de SMD. O grupo SMD foi dividido em SMD I (que inclui casos de SMD com displasia unilinha (n=2) e casos com displasia multilinha (n=6)); SMD II (que inclui casos de SMD com excesso de blastos do tipo 1 (n=3) e tipo 2 (n=7)). Ainda, tendo em conta todos os casos de SMD (n=18), foi definido um terceiro grupo de SMD onde se observou displasia eritroide por morfologia (n=7). No compartimento CD34+ normal, a expressão de CD43 e CD49d mostrou ser bastante mais elevada nos percursores hematopoiéticos comprometidos à linha eritroide em comparação com os percursores comprometidos às outras linhas hematopoiéticas. Na linha eritroide normal, observou-se uma diminuição da expressão de CD43 ao longo da maturação, com uma elevada expressão no estádio I e com uma consequente diminuição até ao último estádio. O padrão de expressão de CD49d foi caracterizado por um aumento de expressão do estádio I para o estádio II, por uma expressão mantida entre o estádio II e III e por uma diminuição constante do estádio III até ao último estádio, que apresentou a menor expressão deste marcador. No grupo SMD, a expressão de CD43 e CD49d mostrou seguir o mesmo padrão observado na MO normal, no entanto, observou-se uma diminuição estatisticamente significativa nos valores da média da intensidade de fluorescência (MIF), em todos os estádios maturativos, para ambos os marcadores, em comparação ao grupo de controlo. Esta diminuição mostrou ser mais acentuada, e com significado estatístico, nos grupos SMD II e SMD com displasia eritroide, quando comparado com o grupo controlo, para ambos os marcadores. Os resultados obtidos ao longo do trabalho reforçam o contributo da CF no diagnóstico das SMD e apontam para a utilidade dos marcadores CD43 e CD49d na caracterização da maturação eritroide, contribuindo deste modo para expandir o painel de marcadores utilizados para o estudo desta linha, e uma vez que ambos os marcadores estão incluídos no painel de diagnóstico DLPC-B, poderiam contribuir para o diagnóstico concomitante de uma neoplasia crónica de células B e uma possível SMD.