Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/86229
Title: Experimental enhancement of cellular OXPHOS reliance for mitochondrial health assessments - Development and characterization of a rapid and efficient method to induce OXPHOS in skin fibroblasts, for the assessment of mitochondiral toxicity and protection.
Other Titles: Aumento experimental da dependência celular na OXPHOS para avaliação da saúde mitocondrial - Desenvolvimento e caracterização de um método rápido e eficiente para induzir OXPHOS em fibroblastos da pele, para avaliação de toxicidade e proteção mitocondrial.
Authors: Costa, Cláudio Figueiredo 
Orientador: Moreno, António Joaquim de Matos
Oliveira, Maria Teresa Martins da Cunha
Keywords: remodelação metabólica; fibroblastos; saúde mitocondrial; OXPHOS-dependência; metabolic remodeling; fibroblasts; mitochondrial health; OXPHOS reliance
Issue Date: 21-Sep-2018
Serial title, monograph or event: Experimental enhancement of cellular OXPHOS reliance for mitochondrial health assessments - Development and characterization of a rapid and efficient method to induce OXPHOS in skin fibroblasts, for the assessment of mitochondiral toxicity and protection.
Place of publication or event: Center for Neuroscience and Cell Biology of University of Coimbra
Abstract: A estimulação da fosforilação oxidativa (OXPHOS) em células em cultura ganhou relevância na última década como uma ferramenta muito importante para estudos nas áreas da toxicologia e biomedicina, servindo para desmascarar a toxicidade mitocondrial seletiva de químicos. Isto pode ser alcançado pela remoção de glicose do meio de cultura, sendo que, porém, há uma grande variabilidade na metodologia na literatura que compromete as comparações entre diferentes trabalhos. Assim, o nosso objetivo foi padronizar e caracterizar as condições de cultivo celular para aumentar a dependência de OXPHOS em fibroblastos de pele (NHDF), com aplicabilidade em estudos para avaliação de saúde mitocondrial.Foram usadas células NHDF cultivadas em meio contendo 25 mM glicose (HGm) e gradualmente adaptadas ou expostas de forma aguda a meio contendo 5 mM glicose (LGm) ou galactose (OXPHOSm). As taxas de consumo de oxigénio (OCR) foram medidas nessas condições usando um Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer. Para entender a importância dos diferentes componentes do OXPHOSm para a estimulação da OXPHOS, também foram medidas as OCR em células cultivadas na presença ou ausência de glutamina, piruvato, galactose e uridina. Além disso, foram comparados também vários parâmetros celulares, como a expressão, níveis e atividade de vários genes e proteínas, o número de cópias do mtDNA, a morfologia da rede mitocondrial, o estado energético das células e também o efeito de algumas substâncias na atividade metabólica ou nos níveis de ATP das mesmas células.Medições de parâmetros associados à OCR indicaram que a adaptação gradual das células em pelo menos uma passagem a OXPHOSm é necessária para a estimulação da OXPHOS. Medições da expressão de CYB em células cultivadas em OXPHOSm em diferente número de passagens sugerem que as células precisam de, pelo menos, duas passagens em OXPHOSm até atingir um plateau de expressão de CYB, o que sugere que os níveis de biogénese mitocondrial levam tempo para estabilizar. Os nossos resultados sugerem também que um fenótipo mais oxidativo é acompanhado por mudanças na expressão e nos níveis de vários genes e proteínas, no número de cópias do mtDNA e na morfologia da rede mitocondrial, sem afetar, porém, o estado energético global das células. Além disso, a toxicidade de venenos mitocondriais foi muito maior e mais consistente em células adaptadas a OXPHOSm, facilitando os estudos de proteção mitocondrial. Em conjunto, os resultados mostram que a adaptação das células NHDF a OXPHOSm aumentou a sua dependência da OXPHOS, algo que não ocorreu logo após exposição aguda a este meio, sensibilizando-as para os efeitos tóxicos das drogas mitocondriais. Estes efeitos foram acompanhados de alterações moleculares nas maquinarias celulares associadas ao metabolismo.
Stimulation of oxidative phosphorylation (OXPHOS) in cultured cells has gained relevance in the last decade as a very important tool for studies in the areas of toxicology and biomedicine, namely by unmasking the selective mitochondrial toxicity of chemicals. This may be achieved by removing glucose from culture media, but there is a great variability in the methodology across the literature that compromises the comparisons between different works. Thus, our objective was to standardize and characterize cell culture conditions to enhance OXPHOS reliance in Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF) cell line, with applicability in mitochondrial health assessments.We used NHDF cells cultured in medium containing 25 mM Glucose (HGm) and gradually adapted, or acutely exposed, to 5 mM Glucose-containing medium (LGm) or to glucose-free galactose-containing medium (OXPHOSm) for different periods. Oxygen consumption rates (OCR) were measured under these conditions using a Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer. To understand the importance of different OXPHOSm components for OXPHOS stimulation, we also measured OCR in cells cultured in the presence or absence of glutamine, pyruvate, galactose and uridine. Furthermore, we compared several cellular parameters, such as the expression, levels and activity of several key genes and proteins, mtDNA copy number, mitochondrial network morphology, the cellular energetic state and the effect of toxicants in metabolic activity and ATP levels of the same cells.Measurements of OCR-associated parameters indicated that gradual cell adaptation in at least one cell passage to OXPHOSm is necessary for OXPHOS stimulation to be observed. Measurements of CYB mRNA expression in cells cultured in OXPHOSm for a different number of passages indicated that cells needed at least two cell passages in OXPHOSm until a plateau of CYB expression was reached, which suggests that the levels of mitochondrial biogenesis take time to stabilize. Our results also suggest that a more OXPHOS-based cellular phenotype is accompanied by changes in the expression and in the levels of several genes and proteins, in mtDNA copy number and in mitochondrial network morphology, without affecting, however, the cellular global energetic state. Also, toxicity of mitochondrial toxicants was increased and more consistent in OXPHOSm-adapted cells, facilitating mitochondrial protection studies.Together, our results show that the long-term adaptation of NHDF cell line to OXPHOSm increased its OXPHOS-reliance, which did not occur shortly after acute exposure to this medium, sensitizing them for the toxic effects of mitochondrial drugs. These effects were accompanied by molecular changes in cellular metabolic machineries.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/86229
Rights: openAccess
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