Adult Oligodendrogenesis in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is one of the most frequent disorders of the central nervous system (CNS), affecting young individuals. MS is an inflammatory disease, characterized by demyelinating events, oligodendrocyte (OLGs) loss, and neuronal degeneration. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) is the most common in vivo model to study MS. In the animal model, the administration of the peptide MOG35-55 leads to the activation of specific CD4+ T cells in the periphery. In addition, Pertussis toxin (PTx) allows the crossing of these immune cells into the CNS, where an inflammatory cascade is triggered with the release of several factors, such as tumour necrosis factor-α (TNFα), interleucin-1β (IL-1β), interferon-γ (IFNγ) or activation of the nuclear factor kappa B (NF-κB) pathway, and the recruitment of macrophages, ultimately leading to myelin loss and neurodegeneration.OLGs are the CNS cells responsible for myelin production. For remyelination, replacement of myelin, to occur, OLG precursor cells (OPCs) have to be recruited. OPCs are present in the brain parenchyma or can be generated by neural stem cells (NSCs) present in the subventricular zone (SVZ). Upon demyelinating conditions, these NSCs can migrate to the lesioned areas, where they differentiate into OLGs that partially remyelinate these regions. Hence, the aim of this work was to characterize the commonly used animal model to study MS, the EAE. Both behaviour and cellular and molecular analysis were performed, and how the process of adult oligodendrogenesis unveils under these demyelinating conditions was assessed. For this, C57BL/6 female 8 weeks-old mice were induced with EAE. The following day, mice received 7 i.p. injections with 2 hour-intervals of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) to label proliferating cells in order to study cell survival and differentiation from SVZ NSCs. Animals were scored daily for the onset and progression of the EAE model, and open field (OF), rotarod (RR) and pole test (PT) were performed two and three weeks after model induction, to assess motor impairment. Four weeks after EAE induction, animals were sacrificed and cellular and molecular characterization of the inflammatory EAE components, as well as of myelin protein levels and adult oligodendrogenesis was performed. Regarding model induction, scores registered for the different experimental groups, in specific-pathogen free (SPF) or virus-antibody free (VAF) environment denoted, as previously described, the influence of the microbiome of the animals in EAE induction: distinct environments lead to different EAE induction patterns. Behavioural results highlight motor impairment of the animals relative to the EAE clinical score. Regarding the cellular and molecular tests, no changes were seen for luxol fast blue tests assessing demyelination in EAE mice. Myelin basic protein (MBP) and proteolipid protein (PLP) levels remained identical between control and EAE groups. Importantly, levels of TNFα were significantly increased for animals housed in SPF conditions, accompanied by a tendency for increased IL-1β levels in these mice, while no alterations were seen for the NF-κB pathway. However, when the animals were sacrificed their clinical scores were already low, due to the endogenous remyelination process that had occurred, justifying the decreased inflammation and the levels of MBP and PLP identical to the control groups. To study the process of oligodendrogenesis, cell survival (BrdU+ cells) and differentiation (cells positive for NG2, a marker of OPCs, and BrdU, NG2+BrdU+ cells) were assessed, in four brain regions of interest: SVZ, where the NSCs are located, and the corpus callosum (CC), cerebral cortex (CT) and striatum (ST), since these are the most affected regions in brain EAE. A tendency for increased cell survival can be observed in the SVZ, CC and CT. Importantly, an increase in NG2+BrdU+ cells for EAE animals in the CC suggests that differentiation of SVZ NSCs into precursors of the oligodendroglial lineage occurred with migration to the CC. In the future, an overall increase in sample size for all the tests performed, as well as sample collection at the time of EAE maximum score will allow for an accurate characterization of the EAE model, its inflammatory cascade, and the mechanisms of new oligodendrocyte formation for the remyelination process. Therefore, this would confirm or dissipate the trends here observed, allowing for the establishment of adult oligodendrogenesis as a potential therapeutic target for MS therapy.

A Esclerose Múltipla (EM) é uma das doenças mais comuns do sistema nervoso central (SNC), afetando jovens adultos. A EM é uma doença inflamatória, que resulta na desmielinização e perda de oligodendrócitos (OLGs), bem como na neurodegeneração. O modelo mais utilizado para os estudos in vivo de EM é a Encefalite Autoimune Experimental (EAE). No modelo animal, a administração do péptido MOG35-55 leva à ativação de células T CD4+ específicas na periferia. Por sua vez, a toxina Pertussis (PTx) permite a passagem destas células imunes para o SNC, onde é desencadeada uma cascata inflamatória com a libertação de fatores e citocinas, como o Fator de Necrose Tumoral-α (TNFα), a Interleucina-1β (IL-1β), o Interferão-γ (IFNγ) ou a ativação da via do Fator Nuclear kappa B (NF-κB), assim como o recrutamento de macrófagos, levando à perda de mielina e neurodegeneração. Os OLGs são as células do SNC responsáveis pela produção de mielina. Para que ocorra o processo de remielinização, em que a bainha de mielina é reposta, são recrutadas células precursoras de OLGs (CPOs), que podem ter origem no parênquima cerebral, mas também na zona subventricular (ZSV). Em condições de desmielinização, estes percursores têm a capacidade de migrar para as regiões lesionadas, onde se diferenciam em OLGs que remielinizam parcialmente essas áreas. Deste modo, o objetivo deste trabalho incidia na caracterização do modelo de EAE, a nível comportamental, mas também dos seus mecanismos celulares e moleculares, e na avaliação do processo de oligodendrógenese neste ambiente patológico. Para tal, murganhos C57BL/6 fêmea com 8 semanas de idade foram induzidos com EAE. No dia seguinte, os animais receberam 7 injeções i.p., com intervalos de 2 horas, de 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU), para marcar células em proliferação para estudar a sobrevivência e diferenciação celulares a partir de células percursoras da ZSV. Foram registados os scores diários dos animais, de acordo com a progressão do modelo de EAE, e os testes comportamentais open field, rotarod e pole test avaliaram os défices motores dos animais. Quatro semanas depois da indução do modelo de EAE, os animais foram sacrificados e procedeu-se à caracterização celular e molecular dos componentes inflamatórios presentes em EAE, assim como dos níveis de proteínas de mielina e do processo de oligodendrogénese. Relativamente à indução do modelo, os registos dos scores obtidos para os grupos experimentais alojados em diferentes ambientes, na ausência de agentes patogénicos específicos (specific-pathogen free - SPF) ou num ambiente isento de vírus e anticorpos (virus-antibody free - VAF) demonstrou, tal como já tinha sido descrito, a influência do microbioma dos animais na indução de EAE: diferentes ambientes levam a padrões distintos de desenvolvimento de EAE.Os resultados dos testes comportamentais demonstraram que os défices na atividade locomotora e coordenação dos animais são proporcionais aos scores registados. A nível celular e molecular, não foram observadas alterações nos níveis de desmielinização em murganhos EAE, avaliados com a marcação histológica de luxol. Os níveis das proteínas MBP e PLP permaneceram também inalterados entre os grupos estudados. Porém, os níveis de TNFα estavam significativamente aumentados nos animais com EAE alojados em instalações SPF, acompanhado por uma tendência para o aumento dos níveis de IL-1β para estes animais. Contudo, não foram observadas alterações para os níveis de NF-κB. No entanto, aquando do sacrifício, os animais já tinham regredido nos seus scores, pelo que o processo de remielinização endógena já tinha ocorrido, justificando assim o decréscimo na inflamação e a presença de níveis de MBP e PLP idênticos aos dos animais controlo. Para estudar o processo de oligodendrogénese, a sobrevivência (células BrdU+) e diferenciação (células positivas para NG2, um marcador de CPOs e BrdU, NG2+BrdU+) celulares foram quantificadas, em quatro regiões de interesse, na ZSV, local onde se encontram as células precursoras, e no corpo caloso (CC), córtex cerebral (CT) e estriado (ES), algumas das regiões mais afetadas em EAE. Uma tendência para o aumento da sobrevivência celular foi observada para a SVZ, CC e CT. De forma relevante, foi observado um aumento no número de células NG2+BrdU+ para os murganhos EAE no CC, o que sugere a ocorrência de diferenciação de precursores da ZSV em células da linhagem oligodendroglial, que terão migrado para o CC. De futuro, o aumento do número de amostras para as experiências realizadas, bem como a recolha das amostras quando os animais apresentarem maior score irá permitir uma adequada caracterização do modelo de EAE, e também dos mecanismos de formação de novos OLGs para o processo de remielinização. Deste modo, será possível confirmar ou dissipar as tendências aqui observadas, permitindo a formulação da hipótese da oligodendrogénese em adulto como potencial alvo terapêutico em EM.