Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/86158
Title: Relevance of astrocytes/microglia communication for NLRP3 signalling in the CNS - proof of concept in an ex vivo epilepsy model
Other Titles: Relevância da comunicação entre astrócitos/microglia para a sinalização do NLRP3 no SNC - validação do conceito num modelo ex-vivo de epilepsia.
Authors: Almeida, Catarina Isabel Carvalhas 
Orientador: Duarte, Carlos Jorge Alves Miranda Bandeira
Castro, Cláudia Alexandra dos Santos Valente de
Keywords: Epilepsia; fatias organotípicas; Astrócitos; Microglia; Inflamassoma NLRP3; Epilepsy; organotypic slices; Astrocytes; Microglia; Inflammasome NLRP3
Issue Date: 21-Sep-2018
Serial title, monograph or event: Relevance of astrocytes/microglia communication for NLRP3 signalling in the CNS - proof of concept in an ex vivo epilepsy model
Place of publication or event: Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
Abstract: As células da microglia e os astrócitos são consideradas as células imunes do cérebro. Estas células, através dos seus recetores, conseguem identificar moléculas invasoras, protegendo o cérebro. Uma das cascatas inflamatórias mais investigadas é a do inflamassoma NLRP3, um complexo multiproteíco citosólico, presente nas células da glia. A formação e ativação deste complexo ocorre por moléculas patogénicas, tais como lipopolissacarídeos (LPS), que culminam na libertação de citoquinas pró-inflamatórias, entre elas, a interleucina-1β (IL-1β). Contudo, o mecanismos de formação do inflamassoma NLRP3 nos astrócitos não é totalmente conhecido.Deste modo, o presente estudo teve por objetivo investigar o processo de comunicação entre microglia/astrócitos e a sua influência na formação do inflamassoma NLRP3 em astrócitos. Pretendeu-se igualmente avaliar se um contexto inflamatório é capaz de induzir atividade epileptiforme em fatias organotípicas.De forma a entender se o inflamassoma NLRP3 se formava em astrócitos, estabeleceram-se culturas primárias de astrócitos, microglia, ou ambos (co-culturas), preparados a partir do córtex de ratos Sprague-Dawley com 2-3 dias. Após duas semanas em cultura, as células foram estimuladas com moléculas ativadoras do inflamassoma NLRP3. O LPS (100 ng/ml, 24h) foi adicionado na presença ou ausência da adenosina trifosfato (ATP, 1 mM, 6h). A morfologia das células da glia foi avaliada por imunocitoquímica e a expressão da proteína NLRP3, em astrócitos e microglia, foi calculada por colocalização. A citoquina IL-1β foi quantificada por ELISA. Os resultados obtidos mostraram que a estimulação LPS e LPS/ATP promoveram a reatividade das células da glia. Os astrócitos tornaram-se hipertróficos, característica de astrogliose moderada. Estas observações foram corroboradas pelo aumento na co-localização entre GFAP e o marcador de astrócitos reativos pSTAT3. A análise da morfologia da microglia mostrou que a microglia ramificada existe predominantemente em condições controlo e, que na presença de estímulos pró-inflamatórios estas células adquirem um fenótipo amoebóide e maior diâmetro, caraterístico de microglias reativas. A incubação LPS ou, LPS/ATP, aumentou a produção e libertação de IL-1β em todas as culturas. Os resultados mostraram que a relação astrócitos/microglia é importante para a produção de IL-1β, visto que nas co-culturas, onde as células gliais podem estabelecer contato direto, os níveis de IL-1β secretada são superiores aos níveis desta citoquina em culturas puras de astrócitos ou de microglia. Culturas puras de astrócitos foram então incubadas durante 48h com meio condicionado proveniente de culturas puras de microglia ou de culturas de microglia ativada por LPS/ATP, tendo-se avaliado os níveis de IL-1β e co-localização entre GFAP/pSTAT3 e GFAP/NLRP3. Os resultados sugerem que o contacto microglia/astrócito poderá promover uma maior ativação do inflamassoma NLRP3 em astrócitos, e apontam para um papel dos fatores secretados pela microglia na regulação da astrogliose. No entanto, é necessário aumentar o número de experiências de forma a confirmar que a ativação do NLRP3 em astrócitos é mediada pela microglia.Alguns estudos recentes apontam para a cascata do inflamassoma NLRP3 como potencial alvo terapêutico no desenvolvimento de fármacos anti-epilépticos. Deste modo, a compreensão da formação deste complexo em células da glia é fundamental. Assim sendo, fatias organotípicas de córtex-hipocampo, foram preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 6-7 dias, com o objetivo de clarificar o papel da neuroinflamação na epileptogénese. A exposição a LPS (10 ng/mL, 6h) e ATP (1 mM, 3h) promoveu a expressão e libertação de IL-1β em fatias organotípicas, corroborando a formação do inflamassoma NLRP3 neste sistema. Também foi possível observar que a pré-incubação com minociclina (30 μM, 24h), fármaco utilizado para inibir especificamente a ativação da microglia, foi capaz de reverter os níveis de IL-1β produzidos pela co-estimulação com LPS/ATP, indicando que as células da microglia são as principais células responsáveis pela formação do inflamassoma e pela produção de IL-1β. Adicionalmente, foram realizados registos extracelulares nas fatias organotípicas para avaliar se a neuroinflamação promovia a ocorrência de atividade epileptiforme. Os resultados mostraram que a incubação com LPS/ATP promove a atividade epileptiforme, e a pré-incubação com minociclina não revertia a probabilidade de atividade das fatias. Ainda assim, a avaliação dos parâmetros intrínsecos dos “bursts” mostrou que o número de eventos por “burst” e a amplitude de cada evento diminuem quando as fatias são pré-expostas à minociclina antes do LPS/ATP. Os “bursts” refletem a atividade neuronal exacerbada, apresentada durante a fase ictal de uma crise epiléptica.Resumidamente, os resultados revelaram que o processo neuroinflamatório promove a epileptogénese e que a reatividade da microglia é essencial neste mecanismo
Microglia and astrocytes are considered the immune cells of the brain. They sense invading molecules and protect the brain against insults. The most investigated inflammatory cascade involves the NLRP3 inflammasome, a cytosolic multiprotein complex present in glial cells. Its assembly and activation by pathogens such as lipopolysaccharides (LPS), and other danger molecules leads to the release of proinflammatory cytokines, with relevance for Interleukin-1β (IL-1β). However, NLRP3 inflammasome assembly in astrocytes is not yet fully understood.The present study aims to investigate the influence of microglia/astrocytes communication for NLRP3 inflammasome assembly in astrocytes, and assess whether an inflammatory context induces epileptiform activity in organotypic slices. Primary cultures of astrocytes, microglia and co-cultures, containing both astrocytes and microglia, were prepared from newborn Sprague-Dawley rats with 2-3 days. After two weeks in culture, LPS (100 ng/ml) was added for 24h with or without adenosine triphosphate (ATP) (1 mM, 6h). The morphology of glial cells was assessed through immunocytochemistry, while expression of NLRP3, within astrocytes and microglia, was evaluated by colocalization studies. IL-1β was quantified by ELISA. Both LPS and LPS/ATP promoted glial cells reactivity. Astrocytes became hypertrophic with more ticker processes typical of moderate astrogliosis, and an increased colocalization between GFAP and the reactive astrocytic marker pSTAT3 was observed. Microglia morphology analysis showed that ramified microglia retracted their processes acquiring an amoeboid activated phenotype with increased cell body diameter. Also, both LPS and LPS/ATP increase IL-1β production in all cultures. Astrocytes/microglia interplay is important for IL-1β production in astrocytes, since IL-1β from co-cultures was higher than the production of this cytokine from pure cultures. Moreover, cultures of pure astrocytes were incubated for 48h with microglia’s conditioned medium or LPS/ATP-activated microglia conditioned medium and the levels of IL-1β and colocalization between GFAP/pSTAT3 e GFAP/NLRP3 were evaluated. The results suggest that astrocytes/microglia interaction might promote NLRP3 activation in astrocytes. However, no statistical results were obtained and further experiments are needed to confirm microglia-mediated NLRP3 activation in astrocytes. Recent studies point to NLRP3 inflammasome cascade as a potential therapeutic target to develop new antiepileptic drugs and understanding the formation of this complex within glial cells is crucial for the development of new therapeutic targets for refractory epilepsies. Hence, organotypic cortex-hippocampus slice cultures, prepared from newborn Sprague-Dawley rats with 6-7 days, were used to assess the role of neuroinflammation in epileptogenesis. Our findings showed that co-incubation of LPS (10 ng/mL, 6h) and ATP (1 mM, 3h) promoted IL-1β expression in organotypic slices corroborating NLRP3 assembly in this system. Results also showed that pre-incubation with minocycline (30 μM, 24h), commonly used to inhibit microglial activation, rescued the increased IL-1β levels caused by LPS/ATP insult, indicating that microglia is the main responsible for NLRP3 assembly and IL-1β secretion. Additionally, extracellular recordings were performed in slices to evaluate the occurrence of neuroinflammation-mediated epileptiform activity. Incubation with both LPS/ATP promoted epileptiform activity, but pre-treatment with minocycline did not reverse this activity probability. Nevertheless, when evaluating burst parameters, minocycline seemed to decrease the number of events per burst and the positive peak amplitude.Altogether, these data show an important role for microglia’s reactivity during neuroinflammation-driven epileptogenesis. Additionally, reactive microglia might be controlling these events through NLRP3 inflammasome cascade, which culminates in IL-1β secretion, and ultimately in astrogliosis induction. The data obtained within this study will be relevant for epilepsy, since the exacerbation of inflammatory responses in activated astrocytes/microglia promotes hyperexcitability, being significantly implicated in the mechanisms of epileptogenesis.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/86158
Rights: embargoedAccess
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