Development of nanosized glucan particles with immunostimulatory function as a delivery syistem for curcumin

Abstract

A curcumina é um composto natural isolado do rizoma da planta Curcuma longa. É um difenol hidrofóbico conhecido pelas suas diversas propriedades farmacológicas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, antimicrobianos e anti-carcinogénicos. No entanto, apesar destas vantagens a curcumina não apresenta uma boa eficácia clínica devido à sua baixa solubilidade em água, reduzida biodisponibilidade e rápida eliminação sistémica. Uma abordagem promissora para resolver esse problema e aumentar a relevância clínica deste composto é encapsulá-lo utilizando um sistema de entrega de fármacos que seja dispersível em meio aquoso. Nesse sentido, as nanopartículas (NPs) ganharam relevância como sistemas de entrega, uma vez que são capazes de melhorar o impacto terapêutico do fármaco ao aumentar o seu tempo de retenção, permitem uma entrega deste composto de forma controlada e ainda proporcionam um melhor direcionamento para alvos selecionados e uma melhor penetração tecidual. Mais recentemente, as nanopartículas poliméricas biodegradáveis têm sido alvo de um crescente interesse, uma vez que permitem uma maior estabilidade nos fluidos biológicos, apresentam uma baixa toxicidade e podem atuar como imunoestimulantes ou adjuvantes. Curdlan é um polímero neutro constituído por resíduos de glicose com ligações β-1,3. É extraído de Alcaligenes faecalis e tem associado diversas aplicações baseadas nas suas propriedades físico-químicas e na sua relevância no campo da medicina. Na literatura, as NPs de glucano têm sido abordadas em diferentes áreas da medicina, como para o tratamento do cancro ou como sistema de entrega de genes. Tendo isso em consideração, este trabalho tem como objetivo desenvolver um método para preparar NPs de glucano com curcumina encapsulada, caracterizar esse sistema e avaliar a sua imunotoxicidade in vitro.O trabalho aqui apresentado descreve a produção de dois sistemas de entrega com dois tamanhos diferentes à base de glucano, para encapsular a curcumina. Estes sistemas foram produzidos através de uma técnica de nanoprecipitação. As suspensões de NPs foram caracterizadas, obtendo-se formulações com índice de polidispersão relativamente baixo e um sistema com tamanho de 100 nm e o outro por volta dos 300 nm. Ambos os sistemas de NPs exibiram uma morfologia em forma redonda e potenciais zeta neutros, apresentando pequenas variações entre cada lote. Também foi observado uma maior estabilidade a 4 ºC por pelo menos 42 dias. Estas características levaram-nos a considerar as NPs poliméricas de 100 e 300 nm prontas para iniciar os estudos com células. O efeito do tamanho das NPs nas propriedades biológicas foi avaliado. Para isso, a imunotoxicidade e os efeitos imunomodulatórios foram testados in vitro numa linha celular de macrófagos de murganho (RAW 264.7) e em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs), dois modelos celulares apropriados para avaliar a interação de NPs com células do sistema imunitário. Além disso, também foi avaliado a compatibilidade das formulações com componentes sanguíneos. Os estudos de viabilidade celular realizados nos dois tipos de células mostraram que as NPs Glu 100 e GluCur 100 apresentam maior toxicidade quando comparadas às NPs Glu 250 e GluCur 350, sendo esta toxicidade associada às partículas e não à curcumina. Esta maior toxicidade das partículas de menor dimensão também foi observada no ensaio de hemólise. No entanto, todos os tipos de formulações apresentaram grande compatibilidade no ensaio dos tempos de coagulação, não alterando o tempo de protrombina e o tempo de tromboplastina parcial ativada. Em relação aos efeitos imunomoduladores, as NPs Glu 250 apresentaram uma maior capacidade imunomoduladora ao levarem à produção de NO e das citocinas TNF-α e IL-1β e também ao induzirem a proliferação de PBMCs. Ao contrário, com o encapsulamento da curcumina, observou-se a inibição da produção de NO e das citocinas TNF-α e IL-1β, evidenciando assim as propriedades anti-inflamatórias da curcumina.Para concluir, neste trabalho descrevemos a produção bem-sucedida de NPs de glucano com curcumina encapsulada como uma estratégia para melhorar a sua reduzida biodisponibilidade. Mais estudos são agora necessários para verificar mais detalhadamente os efeitos imunológicos destes sistemas de entrega, a fim de poder usá-los com segurança em estudos in vivo.

Curcumin is a natural compound isolated from the rhizome of the plant Curcuma longa. It is a hydrophobic diphenol known for its diverse pharmacological activities including antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial and anti-carcinogenic properties. However, despite its advantages, curcumin does not have a good clinical efficacy due to its low aqueous solubility, its poor bioavailability and rapid systemic elimination. A promising approach to solve this problem and enhance curcumin’s clinical relevance is to encapsulate it using a drug delivery system that is dispersible in aqueous media. In this regard, nanoparticles (NPs) have gained importance as drug delivery systems since they improve the therapeutic impact of the drug by enhancing its retention time and allowing a controlled release or even providing better targeting and tissue penetration. More recently, biodegradable polymeric nanoparticles have grown interest since they enable a greater stability in body fluids, they present low toxicity and they can act as immunostimulants or adjuvants. Curdlan is a neutral polymer consisting of β-1,3-linked glucose residues. It is extracted from Alcaligenes faecalis and it has many applications based on its physicochemical properties and in its relevance in the medical field. In the literature glucan NPs have been addressed in different medical fields like for cancer treatment or as gene delivery system. Taking this into account, this work aims to develop a method to prepare curcumin loaded glucan NPs, characterize them and evaluate its immunotoxicity in vitro. The work herein describes the production of two glucan-based delivery systems with 2 different sizes to encapsulate curcumin. These systems were produced through a nanoprecipitation technique. The suspensions of NPs were characterized, having obtained formulations with relatively low polydispersity index and one system with a size of 100 nm and the other around 300 nm. Both NPs, exhibited round shape morphology and neutral zeta potentials, presenting minor variations between each batch. It was also observed a greater stability at 4 ºC for at least 42 days. These characteristics lead us to considerate both 100 and 300 nm polymeric NPs ready to start the studies with cells. The effect of the size of the NPs on biological properties was evaluated. Therefore, the immunotoxicity and immunomodulatory effects were tested in vitro on a murine macrophage cell line (RAW 264.7) and in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), two appropriate cell models to evaluate the interaction of NPs with cells of the immune system. Moreover, it was evaluated the compatibility of the formulations with blood components. The cell viability studies performed in the two cell types showed that Glu 100 and GluCur 100 NPs present a higher toxicity compared with Glu 250 and GluCur 350 NPs, being this toxicity associated with the particles and not curcumin. This higher toxicity of the smaller particles was also observed in the hemolysis assay. However, all types of formulations showed a great compatibility in time coagulation assay, by not altering prothrombin time and activated partial thromboplastin time. In relation to the immunomodulatory effects, Glu 250 NPs presented a higher immunomodulatory capacity by producing NO and the cytokines TNF-α and IL-1β and by inducing the proliferation of PBMCs. Contrary, with the encapsulation of curcumin it was observed the inhibition of NO and the cytokines TNF-α and IL-1β, which evidences curcumin anti-inflammatory property.To conclude, in this work we reported the successful production of curcumin encapsulated glucan NPs as a strategy to improve curcumin low bioavailability. Further studies are now required to access in more detail more immunological effects of these delivery systems in order to safely use it in in vivo studies.