Pochonia chlamydosporia - Biological control agent of root-knot and potato cyst nematodes.

Abstract

Os nemátodes parasitas de plantas (NPP) são altamente especializados, sendo considerados como uma das maiores ameaças às culturas agrícolas. Os NPP economicamente mais importantes, com grande impacto nas culturas a nível mundial, são os nemátodes-das-galhas-radiculares (NGR), Meloidogyne spp., e os nemátodes de quisto da batateira (NQB), Globodera spp. Os NGR estão entre as pragas agrícolas economicamente mais prejudiciais que atacam uma grande variedade de culturas. Espécies de Meloidogyne, como por exemplo M. incognita, são pragas graves presentes em todos os locais, que têm vindo a ser consideradas como as “principais” espécies pois infetam diversas culturas hortícolas importantes, como, por exemplo, o tomate. Os NQB, G. pallida e G. rostochiensis, são uma das pragas mais especializadas e bem-sucedidas na agricultura em todo o mundo, causando grandes perdas nas culturas de batata. O controlo dos NPP envolve a manipulação das densidades de nemátodes para níveis não prejudiciais utilizando diversas estratégias para os reduzir ou eliminar. O controlo biológico através da ação de organismos vivos pode fornecer um método suplementar para a gestão dos NPP. Esta estratégia de gestão baseia-se em métodos ambientais e economicamente eficientes para eliminar pragas e doenças. No entanto, o controlo biológico precisa de ser integrado com outros métodos de controlo, uma vez que é menos eficaz e atua mais lentamente que o controlo químico. O fungo nematófago Pochonia chlamydosporia parasita fêmeas sedentárias e ovos de NGR e NQB. O potencial doa isolados de P. chlamydosporia como agentes de controlo biológico tem sido bastante estudado em ensaios de vasos e campo. No entanto, a eficácia reduzida de alguns isolados no controlo de populações de nemátodes tem sido demonstrada em alguns estudos. A variação intrínseca entre diferentes isolados de P. chlamydosporia requer uma seleção prévia. O processo de seleção é baseado em três critérios-chave, baseados na capacidade de: produzir clamidósporos; colonizar a rizosfera; e parasitar ovos de nemátodes.O objetivo principal do presente estudo foi avaliar o potencial de isolados portugueses de P. chlamydosporia associados a Meloidogyne spp. Especificamente, os isolados foram identificados e caraterizados a nível molecular e foi avaliada a sua capacidade de produzir clamidósporos, de colonizar a rizosfera e de parasitar ovos de NPP. Foram utilizados treze isolados de P. chlamydosporia (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX e os isolados de referência Pc2, Pc10 e 392). A variação genética entre isolados foi avaliada através da técnica de PCR com primers de β-tubulina, ERIC e ITS. Os isolados foram selecionados através de bioensaios in vitro no que diz respeito à sua capacidade de produzir clamidósporos, de colonizar a rizosfera do tomate e parasitar os ovos de M. incognita e de G. pallida.A caraterização molecular de P. chlamydosporia revelou diferenças entre P. chlamydosporia var. chlamydosporia e var. catenulata. Para alguns isolados foram obtidos padrões ERIC-PCR muito semelhantes. A técnica de ERIC-PCR pode ser usada para identificar variações intraespecíficas dentro da espécie.Os melhores produtores de clamidósporos nas três réplicas biológicas foram os isolados II, III, IV e VI. A viabilidade foi superior a 80% para a maior parte dos isolados. A maioria dos isolados colonizou extensivamente a rizosfera do tomateiro (mais de 80% dos fragmentos da raiz), exceto os isolados Ib, IX, IV e V. A proporção de ovos parasitados, detetados em placas de agar, foi baixa para ambas as espécies de nemátodes (inferior ou igual a 60% para NGR e inferior a 55% para NQB). Os isolados Ia e VIII foram os melhores parasitas de NGR, e os isolados V e Pc2 foram os melhores parasitas de NQB. Os isolados Ib e IX foram os piores isolados nos três bioensaios in vitro. Os isolados Ia e VIII poderão ser considerados como potenciais agentes de controlo biológico. Embora, estes isolados não tenham sido os melhores produtores de clamidósporos, os resultados foram consistentes entre replicações biológicas. Além disso, os clamidósporos produzidos por estes dois isolados possuíam elevada viabilidade. São também bons colonizadores das raízes do tomateiro e revelaram serem bons parasitas de ovos em ambas as espécies de nemátodes estudadas. As análises moleculares, bioquímicas e biológicas são decisivas na seleção de potenciais agentes de controlo biológico, particularmente no caso de P. chlamydosporia, devido à elevada variabilidade entre isolados.

Plant-parasitic nematodes (PPN) are highly specialised parasites recognized as one of the greatest threat of agricultural crops. The most economically important PPN which have a great impact on crops worldwide are the sedentary root-knot nematode (RKN), Meloidogyne spp. and potato cyst nematodes (PCN), Globodera spp. Root-knot nematodes are among the most economically damaging agricultural pests attacking a wide range of horticultural and field crops. Meloidogyne species, such as M. incognita, are serious ubiquitous pests being considered as “major” species and infect many vegetable crops, such as tomato. Potato cyst nematodes (PCN), G. pallida and G. rostochiensis, are one of the most specialized and successful PPN pests in agriculture around the world causing major losses in potato crops. The control of PPN involves the manipulation of nematode densities to non-injurious levels using several strategies to reduce or eliminate nematodes. Biological control through the action of living organisms may provide an additional method for the management of these pests. This management strategy is set to promote environmental and economically efficient methods to eliminate diseases and pests. However biological control needs to be integrated with other control methods, as it is less effective and slower acting than chemical control. The facultative nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia parasitises sedentary females and eggs of RKN and PCN. The biological control potential of P. chlamydosporia isolates has been widely studied in pots and fields experiments. However, the reduced efficacy of selected isolates in controlling nematode populations has been demonstrated in some studies. The intrinsic variation between different isolates of P. chlamydosporia requires prior selection. The selection process is based on rapid in vitro tests to evaluate three important criteria, the ability: to produce chlamydospores; to colonise the rhizosphere; and to parasitise egg nematodes.The main goal of the present study was to evaluate the potential of Portuguese P. chlamydosporia isolates associated with Meloidogyne spp. Specifically isolates were identified and characterized at the molecular level and their ability to produce chlamydospores, colonise the rhizosphere and parasitise PPN eggs was evaluated.Thirteen P. chlamydosporia isolates (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX and reference isolates Pc2, Pc10 and 392) were evaluated. Genetic variation between isolates was examined using β-tubulin-PCR, ERIC-PCR and ITS-RFLP and isolates were screened by in vitro bioassays for their ability to produce chlamydospores, colonise the rhizosphere of tomato and parasitise eggs of M. incognita and G. pallida.Molecular characterization of P. chlamydosporia revealed differences between P. chlamydosporia: var. chlamydosporia and var. catenulata. For some isolates, very similar ERIC-PCR patterns were obtained. ERIC-PCR can be used to identify intra-specific variation within the species.The best producers of chlamydospores in the three biological replicates were isolates II, III, IV and VI. The viability was higher than 80% for most isolates. Most of isolates extensively colonised the rhizosphere of tomato (more than 80% root fragments) except isolates Ib, IX, IV and V. The proportion of parasitised eggs, detected on agar plates, was low for both nematode species (less than or equal to 60% for RKN and less than 55% for PCN). Isolates Ia and VIII were best parasites of RKN, and isolates V and Pc2 were the best parasites of PCN. Isolates Ib and IX were the worst isolates in the three in vitro bioassays. Isolates Ia and VIII should be considered as good candidates to be developed as potential biological control agents. Although, they were not the best chlamydospore producers, the results were consistent between biological replicates. In addition, they presented a high rate of germinated chlamydospores, were considered good colonisers of tomato roots and revealed to be good parasites of eggs of both species of nematodes. Molecular, biochemical and biological analyses are determinant in the screening of potential biological control agents, particularly in the case of P. chlamydosporia, due to the high variability among isolates.