Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/83183
Title: DNA methylation dynamics throughout indirect somatic embryogenesis of tamarillo
Other Titles: Dinâmicas da metilação do DNA ao longo da embriogénese somática do tamarillo
Authors: Sanches, Matilde Lopes Telmo Calado 
Orientador: Canhoto, Jorge Manuel Pataca Leal
Testillano, Pilar S.
Keywords: embriogénese somática; metilação do DNA; cultura in vitro; Solanum betaceum; imunofluorescência; somatic embryogenesis; DNA methylation; in vitro culture; tamarillo tree; immunofluorescence
Issue Date: 21-Jul-2017
Serial title, monograph or event: DNA methylation dynamics throughout indirect somatic embryogenesis of tamarillo
Place of publication or event: Centro de Investigaciones Biológicas, CIB-CSIC, Madrid.
Abstract: Os organismos vegetais são dotados de uma plasticidade no desenvolvimento que lhes permite adaptarem-se às alterações do ambiente circundante. A nível celular, o equilíbrio entre estabilidade e plasticidade depende do controle temporal e espacial da expressão genética, organização da cromatina e resposta adequada aos estímulos externos, que podem induzir a reversão e mudança do programa de desenvolvimento das células. Os mecanismos epigenéticos são pedras basilares do desenvolvimento e da aquisição ou perda da capacidade embriogénica, tanto in vivo como in vitro.A embriogénese somática é uma poderosa ferramenta biotecnológica com aplicações práticas na agricultura, como sendo o melhoramento de plantas de cultivo e a sua produção em larga escala. Além disso, a embriogénese somática tem grande utilidade para a investigação na área do desenvolvimento vegetal, uma vez que representa um sistema fiável de embriogénese in vitro no qual praticamente qualquer aspeto fisiológico, morfológico e bioquímico pode ser estudado.Contudo, as espécies arbóreas são frequentemente recalcitrantes à aplicação desta técnica, o que condiciona o progresso científico e o desenvolvimento de soluções proveitosas para a agricultura e silvicultura, nomeadamente a possibilidade de selecionar e propagar características interessantes. Não obstante todas as dificuldades, em algumas árvores a embriogénese somática foi já realizada com sucesso. Um desses casos promissores é a árvore do tamarilho, Solanum betaceum Cav. (Sendt.).No presente trabalho analisou-se o modo como uma das mais relevantes marcas epigenéticas, a metilação de citosinas do DNA, varia ao longo do sistema in vitro de embriogénese somática indireta do tamarilho. Levaram-se a cabo técnicas de quantificação dos níveis totais de metilação do DNA e imunofluorescência da 5-metil-deoxi-citidina (5mdC) em diversas linhas celulares e ao longo dos primeiros estádios de desenvolvimento dos embriões somáticos, permitindo uma caracterização bastante completa do processo.Os resultados revelaram uma tendência geral das linhas de células embriogénicas para proliferar mais e perder capacidade embriogénica quando mantidas em cultura durante um alargado período de tempo. Tais mudanças são acompanhadas de uma progressiva acumulação de metilação de DNA. Os calos não embriogénicos, por sua vez, apresentam elevados níveis de metilação, mesmo quando recentemente induzidos. Quando se comparou o nível de metilação de histonas entre calos embriogénicos e não embriogénicos, a relação encontrada foi semelhante.As massas embriogénicas são histologicamente muito heterogéneas, sendo comum o surgimento de protusões celulares onde a intensidade do sinal de fluorescência da 5mdC é geralmente baixa. As células não embriogénicas possuem grandes vacúolos e núcleos pequenos com cromatina geralmente condensada.À medida que os tecidos somáticos desdiferenciam para formar calo não embriogénico e embriogénico, processo que é conseguido através da aplicação de stress e auxinas no meio de indução, foi observada uma diminuição nos níveis globais de metilação do DNA. Por outro lado, a diferenciação dos embriões somáticos foi acompanhada por um progressivo aumento destes níveis. Contudo, um breve momento de hipometilação após a remoção da auxina do meio poderá ser fulcral para o sucesso da conversão de embriões.O presente trabalho é uma contribuição para a compreensão dos eventos epigenéticos, em particular das oscilações na metilação do DNA, que ocorrem nas células e estruturas específicas da embriogénese somática indireta do tamarilho.
Plants are endowed with a developmental plasticity which allows them to adapt to changes in environmental conditions that surround them. At a cellular level, the balance between stability and plasticity is accomplished through temporal and spatial control of gene expression, chromatin organization and adequate response to external stimuli, which might induce reversion and switch of the fate of a cell population. Epigenetic mechanisms are hallmarks of the regulation of development and acquisition or loss of embryogenic competence both in vivo and in vitro plant systems.Somatic embryogenesis (SE) is a powerful biotechnological tool, with practical applications in agriculture, such as crop improvement and large-scale production. Moreover, SE has great utility for research on plant’s development, since it provides a reliable in vitro system in which almost any physiologic, morphologic and biochemical aspect of embryogenesis can be studied. However, woody species are frequently recalcitrant to this technique, impairing scientific advances and profitable solutions for agriculture and forestry, particularly the possibility of selecting and propagating interesting traits. Despite all the difficulties, successful SE in some tree species has already been achieved. Solanum betaceum Cav. (Sendt.), the tamarillo tree of the solanaceous family, is among those promising cases.In this work it was analysed how one of the most relevant epigenetic marks, cytosine methylation, varies on tamarillo indirect somatic embryogenesis (ISE) in vitro system. Both global DNA methylation levels and immunofluorescence of 5-methyl-deoxy-cytidine (5mdC) were assayed, among different cell lines and throughout the first stages of somatic embryo development, enabling a comprehensive characterization of the process. The results revealed a general tendency of the embryogenic cell lines to proliferate more and lose embryogenic competence, associated with accumulation of DNA methylation, when subcultured for a long time. Non-embryogenic calli, even when recently induced, show high methylation levels. A similar relationship was found when histone methylation was compared between embryogenic and non-embryogenic calli recently induced from the same line.Embryogenic masses are histologically very heterogeneous, often exhibiting protrusions where 5mdC immunofluorescence signal is generally low. Non-embryogenic cells present large vacuoles and small nucleus with condensed chromatin.Throughout dedifferentiation of somatic tissues towards the formation of non-embryogenic and embryogenic calli, achieved with application of stress and auxin-containing induction medium, a global decrease on DNA methylation levels was verified. Otherwise, embryo differentiation was accompanied by a progressive increase of DNA methylation levels. An initial hypomethylation moment, upon auxin removal, might be essential for triggering embryo conversion, though.The present work is a contribution to the understanding of the epigenetic events, particularly the changes on DNA methylation, that occur on cells and particular structures throughout the ISE of tamarillo system.
Description: Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/83183
Rights: embargoedAccess
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