Towards the discovery of novel anti-Influenza agents using a reverse virtual fragment screening approach

Abstract

Os vírus influenza são agentes patogénicos responsáveis por doenças respiratórias – gripe - que afetam a população mundial e caracterizadas por elevada morbilidade e significativa mortalidade. As infeções provocadas pelo vírus da gripe podem ser controladas através de vacinação e medicamentos antivirais. No entanto, as vacinas precisam de reformulação e administração anuais e oferecem proteção limitada. O rápido aparecimento de estirpes de influenza resistentes aos fármacos atualmente comercializados contra o vírus influenza A realça a necessidade de desenvolver novas classes de antivirais.Vários estudos funcionais e estruturais demonstraram que a proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus Influenza é um potencial alvo terapêutico. A NS1 tem um papel principal na replicação do vírus e na supressão do sistema. Esta proteína multifuncional, que participa em interações proteína-RNA e proteína-proteína, e altamente conservada é constituída por dois domínios: o domínio N-terminal constituído por 73 aminoácidos que interage com o ácido ribonucleico (RNA) de dupla cadeia (RBD) e o domínio C-terminal denominado de domínio efetor (ED). Com o intuito de descobrir compostos orgânicos com capacidade de inibir a função da NS1, no presente projeto foi desenvolvido e implementado um protocolo que combina abordagens computacionais e experimentais. Primeiro, e para permitir a validação experimental de novos inibidores, caracterizou-se os domínios RBD e ED da NS1 através de várias técnicas experimentais, incluindo Calorimetria de Varrimento Diferencial (DSC), Dicroísmo Circular (CD), Cromatografia de Exclusão Molecular acoplada a um detetor multiangular de dispersão de luz (SEC-MALS) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Os dados experimentais mostram que, em solução, o ED encontra-se em estado monomérico e o RBD em dímero. O espectro de RMN HSQC 1H-15N do RBD-NS1 revela uma grande dispersão de desvios químicos, demonstrando o alto potencial desta técnica para o rastreio de compostos ligantes através da análise da perturbação dos desvios químicos.A componente computacional deste protocolo assenta na identificação de regiões à superfície da NS1 propensos à interação com moléculas com características semelhantes às de fármacos, seguida do rastreio de pequenas moléculas orgânicas (fragmentos) associados a locais de ligação com elevada similaridade química e topológica de uma biblioteca de estruturas proteicas. As potenciais interações dos fragmentos assim identificados com a NS1 são analisadas mediante acoplagem (docking) dos mesmos aos locais de ligação previstos para esta proteína. Num passo final, e após a seleção e obtenção dos fragmentos mais promissores a partir de fornecedores à volta do mundo, realizou-se a validação experimental das interações por RMN. Na fase final deste projeto já foram testados dois fragmentos e é possível concluir a partir destes resultados preliminares o sucesso do protocolo.

Influenza viruses are major human pathogens responsible for respiratory diseases affecting millions of people worldwide and characterized by high morbidity and significant mortality. Influenza infections can be controlled by vaccination and antiviral drugs. However, vaccines need annual reformulation and administration, and provide limited protection. The rapid emergence of influenza virus strains resistant to current antiviral drugs directed against influenza A highlights the need for the development of new classes of antivirals. Toward this end, several structural and functional studies of influenza non-structural protein 1 (NS1) have identified this protein as a potential therapeutic target. This highly conserved and multifunctional protein is composed of two distinctive structural domains, a 73-residue N-terminal double stranded RNA-binding domain (RBD) and a C-terminal effector domain (ED).With the purpose of discover organic compounds with the ability to inhibit NS1, a protocol combining computational and experimental approaches was designed. First, and to allow the experimental validation of new inhibitors, we have characterized the RBD and ED domains of NS1 with several experimental techniques, such as Differential Scanning Calorimetry (DSC), Circular Dichroism (CD), Size-Exclusion Chromatography coupled with Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The experimental data shows that in solution the ED is in a monomeric state and RBD is a dimer. The 1H-15N HSQC spectrum of RBD-NS1 shows large chemical shift dispersion and thus presents high potential to be used in compound screening based on chemical shift perturbation experiments. The core of the computational protocol is based on the identification of regions in the NS1 surface with molecules with similar features to drugs, followed by screening of small organic molecules (fragments) associated with binding sites with high chemical similarity from a protein database. The possible interactions of the fragments with NS1 are analyzed using docking of the fragments with the binding site of NS1. In the final step, after the selection of the most promising fragments we proceed to the experimental validation using NMR experiments. We tested two fragments and the preliminary results show the success of the protocol.