Development and validation of an analytical method for quantification of dopamine metabolism in plasma samples by LC-MS/MS

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, afetando mais de 6 milhões de pessoas em todo o mundo. Trata-se de um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado, neuropatologicamente, por uma perda de neurónios dopaminérgicos numa região específica do cérebro, nomeadamente a substância negra pars compacta (SNpc), com uma consequente diminuição da dopamina no corpo estriado, e pela presença de corpos de Lewy nos neurónios sobreviventes. O aparecimento de todos estes sinais neuropatológicos está relacionado com o surgimento dos principais sintomas motores, como tremor em repouso, rigidez, bradicinesia e instabilidade postural, que são utilizados no diagnóstico da patologia. Embora não haja cura para a patologia, há um grupo de medicamentos que podem ser utilizados no controlo dos principais sintomas, sendo a levodopa o mais utilizado.Devido à relação entre possíveis alterações no metabolismo da dopamina e o surgimento da doença de Parkinson, tem havido um interesse crescente na análise dos analitos envolvidos. Uma vez que este metabolismo também ocorre no plasma, existe a possibilidade de utilizar esta matriz para desenvolver um possível teste de diagnóstico que permita detetar a doença numa fase precoce. Assim, o principal objetivo do presente trabalho foi desenvolver e validar um novo método analítico para a quantificação do metabolismo da dopamina em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa (LC-MS/MS).Todas as amostras de plasma foram sujeitas ao mesmo processo de precipitação proteica com metanol, sendo depois analisadas pelo sistema LC-MS/MS, no modo MRM .Após o desenvolvimento do método, foram avaliados alguns parâmetros de validação para assegurar a fiabilidade dos dados, nomeadamente a seletividade, a linearidade, os limites de deteção e quantificação, a precisão, a exatidão, a transferência , a eficiência da extração e os efeitos da matriz. Os resultados mostraram que foi possível desenvolver um método para determinar quantitativamente o metabolismo da dopamina em amostras de plasma, bem como aplicá-lo em amostras reais de plasma, a fim de quantificar estas moléculas. O método mostrou-se seletivo para todos os analitos em estudo, uma vez que não houve interferências da matriz. O método também mostrou ser linear para todas as moléculas, em solvente, na gama de trabalho, nomeadamente nos intervalos: 0,05-5,0 pmol/μL para L-tirosina e DA; 0,03-5,0 pmol/μL para 3-MT e HVA; 0,1-6,0 pmol/μL para L-DOPA; e 0,1-5,0 pmol/μL para DOPAC. Nas amostras de plasma, o método foi linear nos intervalos 0,5-10,0 pmol/μL para 3-MT e DOPAC e 0,05-12,0 para HVA.Em solvente, os limites de deteção foram: 0,381; 0,426; 0,424; 0,377; 0,260 e 0,235 pmol/μL para L-tirosina, L-DOPA, DA, 3-MT, DOPAC e HVA, respetivamente. Os limites de quantificação foram: 1,154; 1,290; 1,284; 1,143; 0,787 e 0,714 pmol/μL para L-tirosina, L-DOPA, DA, 3-MT, DOPAC e HVA, respetivamente. Por sua vez, nas amostras de plasma, os limites de deteção foram de 0,852; 0,963 e 1,015 pmol/μL e os limites de quantificação foram 2,581; 2,617 e 3,077 pmol/μL para 3 MT, DOPAC e HVA, respetivamente.Na análise da precisão, os resultados da repetibilidade estavam de acordo com os critérios de aceitação, no entanto, a precisão intermediária apresentou altos valores para todas as moléculas. Em termos de análise de precisão, o método mostrou-se preciso para a quantificação dos analitos.A recuperação do método, nos três níveis de concentração, variou entre 84,9% e 112,1%. Nos efeitos da matriz, obtiveram valores negativos, indicando supressão iónica.Por fim, o método desenvolvido foi aplicado em amostras de plasma que foram recolhidas de um grupo controlo e dois grupos de estudo. No grupo controlo, nenhum composto foi devidamente detetado. Por sua vez, L-DOPA, DOPAC e HVA foram detetados na maioria das amostras de plasma dos grupos de estudo, no entanto, não foi encontrada nenhuma relação entre a dose diária de medicação e a concentração de L-DOPA no plasma.

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease, affecting over than 6 million people across the world. This is a progressive neurodegenerative disorder neuropathologically characterized by a loss of dopaminergic neurons in a specific brain region, namely the substantia nigra pars compacta (SNpc), with a consequent depletion of dopamine (DA) within the striatum, and by the presence of Lewy bodies in the surviving neurons. The appearance of all these neuropathological signs is related to the emergence of the main motor symptoms, for instance resting tremor, rigidity, bradykinesia and postural instability, which are used in the diagnosis of the pathology. Even though there is no cure for the pathology, there are a group of medications that can be used in the control of the main symptoms, being levodopa the most used one.Due to the relationship between possible changes in dopamine metabolism and the arise of Parkinson’s disease, there has been a growing interest in the analysis of the involving analytes. Since this metabolism also occurs in the plasma, there is the possibility to use this matrix to develop a possible diagnose test that allows to detect the disease in an early stage. Then, the main purpose of the current work was to develop and validate a new analytical method for the quantification of dopamine metabolism in plasma samples by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). All the plasma samples were subjected to the same protein precipitation procedure with methanol, being then analyzed by the HPLC-MS/MS system, in the MRM mode. After the development of the method, some validation parameters were evaluated in order to assure the reliability of the current data, namely selectivity, linearity, limits of detection and quantification, precision, accuracy, carry-over, recovery and matrix effects.The results showed that it was possible to develop a method to quantitatively determinate dopamine metabolism in plasma samples, as well as to apply it in real plasma samples, in order to quantify these molecules. The method proved to be selective for all the analytes under study, since no matrix interferences occur. The method also showed to be linear for all the molecules in solvent over the working range, namely in the intervals: 0.05-5.0 pmol/µL for L-tyrosine and DA; 0.03-5.0 pmol/µL for 3-MT and HVA; 0.1-6.0 pmol/µL for L-DOPA; and 0.1-5.0 pmol/µL for DOPAC. In plasma samples, the method was linear in the intervals: 0.5-10.0 pmol/µL for 3-MT and DOPAC and 0.05-12.0 for HVA.In solvent, the limits of detection were: 0.381, 0.426, 0.424, 0.377, 0.260 and 0.235 pmol/µL for L-tyrosine, L-DOPA, DA, 3-MT, DOPAC and HVA, respectively. The limits of quantification were: 1.154, 1.290, 1.284, 1.143, 0.787 and 0.714 pmol/µL for L-tyrosine, L-DOPA, DA, 3-MT, DOPAC and HVA, respectively. In turn, in plasma samples, the limits of detection were 0.852, 0.963 and 1.015 pmol/µL and the limits of quantification were 2.581, 2.617 and 3.077 pmol/µL for 3-MT, DOPAC and HVA, respectively.In the precision analysis, the repeatability results were in accordance with the acceptance criteria, however, intermediate precision presented high values for all the molecules. In terms of accuracy analysis, the method proved to be accurate to the quantification of the analytes.The recovery of the method, at three levels of concentration, ranged from 84.9% to 112.1%. In matrix effects, negative values were obtained, indicating ion suppression.Finally, the developed method was applied in plasma samples that were collected from a control group and two study groups. In control group, no compound was properly detected. In turn, L-DOPA, DOPAC and HVA were detected in most of plasma samples of the study groups, however, no relation between the daily dose of medication and the concentration of L-DOPA in the plasma was found.