Analysis of Shank2/Shank3 loss during neuronal development

Abstract

As desordens do Espectro Autista (Autism Spectrum Disorders - ASDs) são patologias neuropsiquiátricas caracterizadas por diferentes sintomas tais como comportamentos repetitivos, défices linguísticos e dificuldade em socializar. Nos últimos anos, diferentes estudos têm revelado que disfunções ao nível das sinapses poderão ser a principal causa para estes sintomas. Além disso, mutações em genes que codificam proteínas sinápticas têm sido reportadas em diferentes casos clínicos de ASD. Embora estas alterações a nível sináptico pareçam ser as que mais contribuem para esta patogénese, os mecanismos biológicos e moleculares pelos quais estas sinapses são afetadas são ainda pouco compreendidos. Assim, para melhor compreender como é que os défices sinápticos influenciam o desenvolvimento neuronal, o foco do nosso trabalho foi estudar o papel de duas proteínas cruciais na estrutura sináptica: Shank2 e Shank3. Estas duas proteínas encontram-se mutadas em alguns dos casos clínicos de ASD reportados, o que consequentemente nos permite estudar qual a contribuição destas alterações sinápticas para a patogénese de ASDs.Assim, recorremos à Microscopia Eletrónica para investigar a contribuição das proteínas Shank durante alterações morfológicas ao nível da sinapse, induzidas por um método não convencional (privação de nutrientes). Além disso, realizámos também ensaios imuno-histoquímicos para perceber como é que diferentes marcadores sinápticos são afetados durante o tratamento. Uma vez que estamos também interessados em conhecer o papel destas proteínas a nível fisiológico, estabelecemos culturas neuronais primárias de diferentes regiões cerebrais (hipocampus e córtex) derivadas de um novo modelo animal: murganhos com KO duplo e condicional de Shank2-3. Este sistema in vitro foi utilizado para deletar os genes da SHANK2 e da SHANK3 em diferentes estágios de neuro desenvolvimento celular, de forma a mimetizar a falha destas proteínas em diferentes fases do desenvolvimento neuronal e assim investigar a contribuição destas proteínas neste processo. Curiosamente, observámos que a proteína Shank3 parece não ser afetada pelas alterações sinápticas induzidas pela privação de nutrientes, no entanto, relativamente à proteína Shank2, esta condição parece influenciar negativamente a sua regulação nas sinapses. Embora estas proteínas partilhem estruturas moleculares semelhantes, este resultado é indicador de que existem diferentes elementos da família de proteínas Shank a contribuir para a regulação destas proteínas nas sinapses através de mecanismos celulares distintos. Contudo, a proteína Homer, descrita na literatura como uma das principais parceira das Shanks, encontra-se estabilizada nestas sinapses, mesmo quando a arquitetura da PSD parece ser drasticamente afetada como consequência da remodelação sináptica. Por outro lado, na ausência das proteínas Shank2 e Shank3 o recrutamento e estabilização da proteína Homer ao nível das sinapses parece ser comprometida. Em conjunto, estas observações indicam que além de permitirem plasticidade à sinapse, estas proteínas parecem desempenhar um papel crucial na organização molecular destas estruturas.Além disso, observámos também que as disfunções sinápticas induzidas pela perda de Shank2 e Shank3, no início do desenvolvimento neuronal, induzem o aumento de Bassoon pré-sináptico, enquanto que o efeito contrário é observado quando deletamos as proteínas Shank em fases tardias do desenvolvimento neuronal.Além disto, foi também observado que a deleção dos genes SHANK2 e SHANK3 induzem apenas alterações morfológicas nas culturas primárias de hipocampus, sugerindo que alguns tipos de células poderão ser mais suscetíveis à perda de proteínas Shank do que outras.Em suma, os nossos resultados fornecem evidências de que alterações no desenvolvimento neuronal e sináptico dependem (i) do tipo de células, (ii) da específica deleção das proteínas Shank e (iii) do estágio de neuro desenvolvimento. Os resultados apresentados são bastante importantes para uma melhor compreensão das alterações nos contactos sinápticos que ocorrem durante o processo de desenvolvimento dos modelos animais utilizados (murganhos com KO duplo e condicional de Shank2-3), as quais parecem ser dependentes da região cerebral.

Autism Spectrum Disorders (ASDs) are heterogeneous neuropsychiatric pathologies characterized by different core features such as repetitive behaviours, language impairment and difficulties in social interactions. In the last years several lines of evidences have pointed out the key contribution of synaptic impairments in this particular diseases. Moreover, several genes, which happen to be mutated in ASDs, encode for synaptic proteins such as Shanks. Although alterations at the synaptic microenvironment appear to strongly contribute in ASDs pathogenesis, the biological and molecular mechanisms affecting these specific neuronal structures are still poorly understood.To better understand how synaptic impairment might influence those behavioural traits that are impaired in ASDs, we investigated the role of two major scaffold proteins at the synapse: Shank2 and Shank3. Those two proteins are mutated in some monogenicforms of ASD, giving us the possibility to investigate synaptic alterations that might specifically contribute to the pathogenesis of neuropsychiatric disorders.To this end, we investigated the contribution of Shanks in synaptic morphological changes through Transmission Electron Microscopy under non-conventional synaptic plasticity induction (starvation). In addition, we performed canonical immunohistochemistry analysis to better elucidate the changes occurring with respect to different synaptic markers that could be triggered by alterations in Shank family members. Moreover, to point out the specific role of Shank2 and Shank3 in the maintenance of a physiological synaptic environment and in a proper synaptic development, we established primary neuronal cultures from a novel conditional Shank2-3 double KO mouse model. This in vitro system was used to knock down the expression of the two scaffold proteins at different stages of cultivation to investigate the specific contribution of Shanks during neurodevelopment and synaptogenesis.Interestingly, while Shank3 seems to be unaffected to synaptic remodelling by starvation we observed a slight down-regulation of Shank2. Although both scaffolding proteins share similar domain composition, these data highlight the idea that distinct elements of the same Shank protein family might contribute to different synaptic signalling pathways. Nevertheless, the well-described Shank binding-partner Homer was found stabilized at synapses even when the ultrastructural postsynaptic density (PSD) architecture was seen to dramatically reduce in response to synaptic remodeling induction. In contrast, the absence of both Shank2 and Shank3 proteins seems to compromise the assembly of Homer into new synaptic contacts. Taken together, these findings indicate that in addition to providing synaptic dynamics, Shank scaffolding proteins also play a crucial role in stabilizing the molecular synaptic composition. We also provided evidences that the postsynaptic abnormalities induced by Shank2 and Shank3 loss at early stages of development lead to an up-regulation of the presynaptic scaffolding protein Bassoon while the opposite effect was observed when Shanks are disrupted at later stages (later on). This, suggests that the disruption of Shank proteins at distinct stages of neuronal development might affect different processes during synaptogenesis.Furthermore, a variability of phenotypes was also found between distinct cell types. For instance, whereas Shank2 and Shank3 deficient hippocampal neuronal cell cultures seem to undergo dendritic morphological changes, no effects were observed in primary cortical dendritic arborization complexity, suggesting that distinct cell types could be more vulnerable to Shank loss.In summary, the investigations provide evidence for neurodevelopment and synaptic alterations in a cell culture system that are depending (i) upon the neuronal cell type, (ii) upon the deletion of a specific Shank family member and (iii) upon the stage of neuronal maturation. The data are important with respect to ASD related developmental alterations of synaptic contacts in Shank model systems that were found to be brain region specific.