ARHGAP8 co-regulates excitatory and inhibitory synapse function

Abstract

A remodelação das estruturas sinápticas, dependente do tipo de estímulos que recebem, é o mecanismo molecular responsável pela plasticidade dos circuitos neuronais – um processo que se julga estar na base da aprendizagem e da memória. O processamento de informação e a plasticidade dos circuitos no sistema nervoso central dependem do equilíbrio entre a função excitatória e a função inibitória. O estabelecimento de uma correta transmissão glutamatérgica (excitatória) e GABAérgica (inibitória) é essencial para o controlo do equilíbrio entre excitação e inibição e para o funcionamento normal dos circuitos neuronais; a perda deste equilíbrio está geralmente associada ao desenvolvimento de neuro-psiquiátricos. As GTPases são uma família de proteínas associadas com a regulação do citoesqueleto de actina, e que têm um papel relevante no desenvolvimento e plasticidade da sinapse. As GTPases apresentam um ciclo de activação (quando ligadas a GTP) e inactivação (quando ligadas a GDP) que é regulado pelos factores de troca de nucleotídeos de guanina (GEFs) e pelas proteínas activadoras de GTPase (GAPs), respectivamente. Apesar de existirem dezenas de GEFs e GAPs no cérebro (um número superior ao de GTPases), a função da maioria destas proteínas ainda não foi descrita. Tipicamente, as proteínas reguladoras de GTPases possuem vários domínios proteicos, que lhes conferem um papel importante como integradores de sinalização intracelular. Uma vez que as GTPases estão envolvidas em vários processos do desenvolvimento neuronal, como por exemplo, a migração neuronal, a formação da árvore dendrítica e o desenvolvimento sináptico – quer excitatório quer inibitório, a sua regulação é de extrema importância para o normal desenvolvimento dos circuitos neuronais e normal função cognitiva. De facto, distúrbios na sinalização pelas GTPases podem causar defeitos sinápticos que originam défices cognitivos. Para além disso, mutações em genes que codificam proteínas reguladoras e sinalizadores das GTPases já foram extensamente associadas a défices cognitivos e outros distúrbios comportamentais. Neste estudo, focamo-nos na caracterização da função neuronal da proteína ARHGAP8, uma nova proteína potenciadora da actividade de GTPases de Rho-GTPases. Resultados preliminares do nosso grupo indicam que a proteína ARHGAP8 está presente nas densidades pós-sinápticas das sinapses excitatórias e que esta GAP pode estar envolvida na regulação deste tipo de sinapses. Tendo em consideração esta hipótese, foram realizadas experiências com o objectivo de testar os efeitos da sobre-expressão de ARHGAP8 na transmissão sináptica mediada por receptores AMPA. Os nossos resultados demonstraram que a sobre-expressão de ARHGAP8 causa uma diminuição na frequência e amplitude de correntes excitatórias pós sinápticas miniatura, o que indica que a proteína ARHGAP8 regula negativamente a transmissão sináptica excitatória mediada pelo receptor AMPA. Para além disto, caracterizámos a presença desta proteína nas sinapses inibitórias. Os nossos resultados indicam que a proteína ARHGAP8 está presente nas sinapses inibitórias e que regula a acumulação de marcadores sinápticos inibitórios. Estes resultados sugerem que a proteína ARHGAP8 coordena o desenvolvimento de ambos os tipos de sinapses (excitatórias e inibitórias). Mais experiencias são necessárias de forma a desvendar os mecanismos através dos quais a proteína ARHGAP8 regula a transmissão sináptica medida por receptores AMPA e a composição da sinapse inibitória, bem como, para avaliar se a proteína endógena está envolvida na regulação de sinapses excitatórias e inibitórias.

The activity-dependent modifications of synaptic strength are the molecular mechanism that underlie circuit plasticity, the molecular device for learning and memory. However, maintaining proper balance of excitation and inhibition (E/I balance) is critical for information processing and plasticity in the central nervous system (CNS). Correct excitatory glutamatergic transmission and inhibitory GABAergic signalling are essential for tight control of E/I balance and normal neural circuit function, and disruption of E/I often underlies the development of neuropsychiatric disorders. As key regulators of the actin cytoskeleton, Rho-family GTPases play a critical role in synapse development and plasticity. They shuttle between an active GTP-bound form and an inactive GDP-bound form. Their activation and inactivation cycle is under the regulation of guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs), respectively. Even though dozens of GEFs and GAPs have been detected in the brain (outnumbering Rho GTPases), the function of most of them has not been elucidated. Rho-regulatory proteins typically comprise multiple signalling domains, playing an important role as key signalling integrators and scaffolds. Given that Rho GTPases regulate a myriad of neurodevelopmental processes including neuronal migration, dendritic arborization and synaptogenesis, their precise regulation is important for circuitry development and normal cognitive function. In fact, aberrant Rho GTPase signalling can cause synaptic defects that can ultimately lead to cognitive impairments. Furthermore, mutations in genes encoding regulators and effectors of the Rho GTPase family have already been associated with intellectual disability (ID) and other neurodevelopmental disorders.Here, we focus on the characterization of a novel Rho-GTPase activating protein, ARHGAP8, in the brain. Preliminary data from our group showed that ARHGAP8 is present at the post-synaptic densities of excitatory synapses in an NMDA receptor-dependent way, and that this Rho-GAP might be involved in the regulation of excitatory synapses. Considering this hypothesis, further studies were conducted testing the functional effects of overexpressing ARHGAP8 in AMPA receptor-mediated transmission. Our data show that overexpression of ARHGAP8 decreases the amplitude and frequency of miniature excitatory post-synaptic currents, indicating that ARHGAP8 downregulates AMPA receptor-mediated excitatory synaptic transmission. Furthermore, we characterized the presence of this protein in inhibitory synapses to further extend our knowledge of its role in neurons. Our results indicate that ARHGAP8 is present in inhibitory synapses, and regulates the synaptic accumulation of inhibitory synapse markers. Collectively, these observations suggest that ARHGAP8 coordinates the development of excitatory and inhibitory synapses. Further investigation should be done in order to unravel the mechanisms through which ARHGAP8 modulates AMPAR-mediated synaptic transmission and inhibitory synapse composition, and to evaluate if endogenous ARHGAP8 is involved in the regulation of both excitatory and inhibitory synapses.