Detection of new actionable mutations in lung cancer precision therapy

Abstract

O cancro de pulmão é a causa mais comum de morte por cancro, em todo o mundo, em ambos os sexos. Cerca de 80% a 85% dos casos de cancro de pulmão são pacientes com cancro de pulmão de não pequenas células (CPNPC), sendo os restantes 15% -20% cancro de pulmão de pequenas células (CPPC). O CPNPC é dividido em três grupos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes. Entre eles, os casos de adenocarcinoma representam cerca de 40 a 50% dos pacientes com CPNPC. O prognóstico para CPNPC é baixo, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos inferior a 20% sendo esta, ainda, pior para o CPPC, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos inferior a 5%.Durante muito tempo, os tratamentos de primeira linha foram a cirurgia, a quimioterapia ou a radioterapia. No entanto, a descoberta de várias mutações drivers da carcinogénese em pacientes com CPNPC, especialmente em casos de adenocarcinoma, permitiu o desenvolvimento de tratamentos personalizados com base nessas alterações moleculares específicas. Deste modo, as mutações no EGFR (Recetor do Fator de Crescimento Epidérmico) representam até 15% dos adenocarcinomas e ocorrem principalmente no domínio tirosina quinase (TK) do gene. Mais de 80% dessas mutações consistem em deleções in-frame no exão 19 e na mutação pontual L858R no exão 21. Tais mutações induzem uma ativação constitutiva do EGFR, tornando-se um potencial alvo terapêutico. Assim, os pacientes portadores de mutações no EGFR podem beneficiar de um tratamento específico de primeira linha, mais especificamente, de inibidores de TK (TKI) que, de forma competitiva, inibem a fixação da adenosina trifosfato (ATP) ao local de ligação catalítica do domínio TK. Foram, também, propostos outros driver biomarcadores em cancro de pulmão podendo, alguns deles, fornecer informações adicionais para a tomada de decisões clínicas.Desta forma, o objetivo principal deste projeto foi avaliar mutações noutros alvos potencialmente acionáveis - MET e ERBB2 - em pacientes com adenocarcinoma, através da sequenciação de Sanger, e desenvolver um ensaio multiplex de PCR em tempo real, para uma rápida e sensível avaliação do estado mutacional em tecido e em plasma. Este ensaio também dará a oportunidade de monitorizar a evolução do estado mutacional no plasma durante o tratamento, para a predição de recidiva e controlo do aparecimento de clones com mutações de resistência.Do total de 172 amostras, 161 (88,9%) foram classificadas como negativas para alterações nos exões 18, 19, 20 e 21 do EGFR, enquanto 19 (11,1%) foram classificadas como positivas. No total das 19 alterações encontradas no EGFR, 73,7% foram deleções no exão 19 e 21% relataram a mutação Leu858Arg. Um caso de uma alteração T790M foi, também, encontrado num paciente. Numa frequência mais baixa, um caso Leu861Gln também foi relatado. No gene MET, as mesmas 172 amostras foram, igualmente, analisadas. Destas, 9 amostras (5,2%) apresentaram alterações no gene, incluindo 2 variantes intrónicas, 2 mutações indel e 5 mutações pontuais, no exão 14. As alterações no ERBB2 foram analisadas em 69 amostras, tendo sido detetado um caso de inserção de 12 bases no exão 20.Este trabalho permitiu concluir que uma proporção importante de casos apresenta mutações no MET e ERBB2, sendo que tais pacientes poderiam ser tratados com fármacos aprovados para esses alvos.

Lung cancer is the most common cause of cancer death around the world, in both sex. About 80%–85% of lung cancer cases are non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients, the remaining 15%–20% are small-cell lung cancer (SCLC). NSCLC is divided into three categories called: adenocarcinoma, squamous-cell carcinoma and large cell carcinoma. Among them, adenocarcinoma cases account for around 40-50% of NSCLC patients. The prognosis for NSCLC is low with a five-year survival rate of less than 20%, and is even worse for SCLC with a five-year survival rate of less than 5%.For a long time, the first-line treatments have been surgery, chemotherapy or radiotherapy. However, the discovery of several oncogenic driver mutations in patients with NSCLC, adenocarcinoma cases in particular, has allowed the development of personalized treatments based on these specific molecular alterations. Therefore, EGFR (epidermal growth factor receptor) mutations account for up to 15% of adenocarcinoma and primarily occurred in the tyrosine kinase (TK) domain of the gene. More than 80% of these mutations consist of in-frame deletions in exon 19 and the L858R point mutation in exon 21. Such mutations induced a constitutive activation of EGFR, making it a potential therapeutic target. Thus, EGFR-mutated patients can benefit from a specific first-line treatment specifically the TK inhibitors (TKI) that competitively inhibits fixation of adenosine triphosphate (ATP) in the catalytic binding site of TK domain. Other driver biomarkers in lung cancer have also been proposed and some of them might provide additional information for clinical decision-making. In this way, the main goal of this project was to evaluate mutations in other potentially actionable targets – MET and ERBB2– in patients with adenocarcinoma by Sanger sequencing and to develop a Real Time PCR multiplex assay for rapid sensitive assessment of mutation profile in tissue and plasma. This assay, will also give the opportunity to monitor the evolution of mutational status in the plasma during the treatment for the prediction of relapse and control the appearance of clones with resistance mutations.Of the total of 172 samples, 161 (88.9%) were classified as negative for alterations in exons 18, 19, 20 and 21 of EGFR, whereas 19 samples (11.1%) were classified as positive. In total of the 19 alterations in EGFR, 73.7% were deletions in exon 19 and 21% was related to Leu858Arg mutation. A case of a T790M alteration was also founded in a patient. At a lower frequency, a case of a Leu861Gln was also reported. In MET gene, the same 172 samples were, also, analyzed. Of these, 9 samples (5.2%) harbored alterations in MET gene, including 2 intronic variants, 2 indel mutations and 5 pontual mutations in exon 14. ERBB2 alterations were analyzed in 69 samples and one case of an insertion of 12 bases in exon 20 were detected.This work allowed us to conclude that an important proportion of cases harbors mutations in MET and ERBB2 and these patients could potentially be treated with approved drugs for these targets.