A influência do microambiente da cavidade oral na diferenciação de células tipo estaminal

Abstract

Introdução: A pesquisa em Medicina Dentária regenerativa avançou significativamente, devido à identificação de células estaminais dentárias. Várias fontes de células estaminais são conhecidas, tanto de origem oral quanto sistémica. No entanto, a colheita dessas células apresenta algumas limitações, portanto, novas fontes de células estaminais são necessárias. A desdiferenciação de células orais adultas é uma metodologia que nosso grupo tem estudado. A influência do microambiente na diferenciação celular é conhecida, assim, a interação entre células estaminais e fibroblastos gengivais é de grande interesse em futuros procedimentos regenerativos.Objetivo: Este trabalho tem como objetivo avaliar a interferência dos meios condicionados de fibroblastos gengivais na viabilidade e diferenciação de células tipo estaminal.Métodos: Uma cultura primária de fibroblastos gengivais de murganho foi obtida por metodologia de explante e cultivada sob condições aderentes. Após a distribuição das culturas celulares por placas de múltiplos poços, foi realizado um protocolo de desdiferenciação de 4 dias para obter células do tipo estaminal. Estas células foram incubadas por 48 horas com o meio condicionado por várias concentrações de fibroblastos gengivais. A atividade metabólica, o teor de proteína e a quantidade de DNA foram avaliados pelos ensaios de MTT, SRB e cristal violeta, respetivamente. A morfologia das células diferenciadas foi avaliada por coloração com cristal violeta e May-Grunwald Giemsa. Alterações morfológicas da diferenciação de linhagem foram avaliadas com coloração de Alizarin Red, Alcian Blue e Oil Red O.Resultados: O meio condicionado por fibroblastos gengivais não alterou significativamente a atividade metabólica, os teores de proteína e DNA das células tipo estaminal. Todos os grupos apresentaram alterações morfológicas compatíveis com fenótipo tipo estaminal e foram observadas diferenças fenotípicas entre os grupos, mas não se verificou diferenciação osteogénica, condrogénica e adipogénica. Discussão / Conclusões: O tratamento com meio condicionado de fibroblastos gengivais garantiu a viabilidade celular, contudo não promoveu a diferenciação celular.

Introduction: Regenerative dentistry research has advanced significantly, much because of the identification of dental stem cells. Various sources of stem cells are known, both of oral and systemic origin. However, harvesting these cells poses some limitations, therefore, new sources of stem cells are needed. Dedifferentiation of adult oral cells is a methodology our group has been studying. Influence of microenvironment in cell differentiation is known, thus the interaction between stem-cells and gingival fibroblasts is of great interest regarding future regenerative procedures. Aim: This work aims to evaluate the interference of gingival fibroblast conditioned media in stem-like cells viability and differentiation. Methods: A primary culture of mouse gingival fibroblasts was obtained by explant methodology and cultured under adherent conditions. After plating, a 4-day dedifferentiation protocol was performed to obtain stem-like cells. These cells were incubated for 48 hours with media conditioned by several numbers of gingival fibroblasts. Protein content and DNA amount were evaluated by SRB and crystal violet assays, respectively. Differentiated cells morphology was evaluated by crystal violet and May-Grunwald Giemsa staining. The morphological alterations of the lineage differentiation were evaluated with Alizarin Red, Alcian Blue and Oil Red O staining.Results: Gingival conditioned media did not alter significantly the protein and DNA contents of stem-like cells. All groups show morphological changes compatible with stem-like phenotype and phenotypic differences were observed between groups, but there was no osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation.Discussion / Conclusions: Treatment with gingival fibroblasts conditioned media ensured cell viability, however did not promote cell differentiation.