Defining Transcriptional Networks Underlying Dendritic Cell Heterogeneity Using Direct Cellular Reprogramming

Abstract

Estratégias de reprogramação celular têm evidenciado a flexibilidade do destino celulare, através de fatores de transcrição (FTs) específicos dos tipos celulares para converter células somáticas em pluripotentes. A reprogramação direta de um tipo de célula diferenciada em outr,o também foi demonstrada e explorada para elucidar os mecanismos de biologia celular e para fins de medicina regenerativa. Recentemente, demonstrámos que células dendríticas (CDs) apresentadoras de antigénios, podem ser reprogramadas em tipos de células diferentes,através da combinação de FTs. Classicamente, pensa-se que um progenitor específico da linhagem mielóide origina subgrupos de CDs funcionalmente diferentes: CDs convencionais (cCDs) são células apresentadoras de antigénios que desencadeiam respostas imunitárias; CDs plasmocitóides (pDCs) são células que produzem Interferão tipo I durante uma infecção viral. No entanto, os mecanismos exactos que regulam a divergência dos diferentes subtipos celulares durante o desenvolvimento das CDs ainda necessitam de ser estabelecidos. Recentemente identificámos os FTs Irf8, Pu.1 e Batf3 como suficientes e necessários para reprogramar fibroblastos em cCDs do tipo 1. Dado o papel importante dos FTs nas decisões de destino celular das diferentes CDs, o objetivo deste estudo é investigar a heterogeneidade das DCs através da caracterização mínima dos FTs e necessária para induzir DCs a partir de fibroblastos. Combinando a revisão bibliográfica e análise computacional, identificámos 23 TFs candidatos com potencial para originar pCDs, que demonstraram ter um papel importante na especificação de pCDs. Validámos em ratinho o repórter Clec9a que, é expresso em pCDs, através da proteína fluorescente tdTomato tornando este modelo adequado para o rastreamento de pCDs originadas pela sobreexpressão de FTs. Em seguida, fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs) com o repórter Clec9a, foram transduzidos com um conjunto de FTs indutores de pCDs, usando um sistema lentiviral induzido por doxiciclina. Através da eliminação individual de cada TF, identificámos Irf8 e TF2 como a combinação mínima necessária para a activação do repórter. A expressão de moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe II, importante para a funcionalidade das DCs, também foi observada como dependente do Irf8 e TF2. Além disso, este estudo destacou o papel do TF1 na especificação das pCDs. Embora não seja intrinsecamente necessário, quando combinado com Irf8 e TF2, o TF1 aumenta a expressão de marcadores de superfície típicos de pCDs, que origina células tdTomato + B220 + Bst2 + pCD-like por reprogramação direta. Em resumo, este estudo fornece evidências de que o Irf8 quando combinado com o TF2 e o TF1 inicia um programa de reprogramação de fibroblastos em pCDs. Estas descobertas fornecem informações valiosas sobre a especificação de pCDs. No futuro, a geração de pCDs por reprogramação direta abre caminhos para a indução de respostas imunes antivirais através de células de engenharia autóloga.

Cellular reprogramming strategies have highlighted the flexibility of cell fates with the possibility to use cell-type-specific transcription factors (TFs) to convert somatic cells into pluripotency. Direct lineage conversions of one differentiated cell-type into another have also been demonstrated and explored for elucidating cell biology mechanisms and for regenerative medicine purposes. Recently, we have demonstrated that antigen presenting Dendritic cells (DCs) can be reprogrammed into unrelated cell-types by a small combination of TFs. Classically, it is thought that a myeloid DC committed progenitor gives rise to the functionally different DC subsets: conventional DCs (cDCs) are professional Antigen Presenting Cells (APC) driving antigen-specific immune responses; plasmacytoid DCs (pDCs) are professional producers of type I interferons during viral infection. However, the timing and exact mechanisms regulating the divergence of the different subsets during DC development is still to be established.We have recently identified Irf8, Pu.1 and Batf3 as sufficient and necessary to induce a cDC type 1 fate in fibroblasts. Given the important role of TFs in cell-fate decisions of the different DC subsets, the aim of this study is to investigate DC heterogeneity by fine-tuning the minimal TF network necessary to induce DC fate in order to program pDCs from fibroblasts.By combining literature review and computational analysis, we have identified 23 pDC-inducing candidate TFs with important roles in pDC specification and restricted pDC expression. We have then validated that in Clec9a reporter mouse, pDCs are labelled with tdTomato fluorescent protein making this model suitable for screening pDC-inducing factor. Then we have transduced Clec9a reporter mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with a set of the pDC-inducing TFs using a doxycycline-induced lentiviral system. By sequential individual elimination of each TF, we have identified Irf8 and TF2 as the minimal combination required for reporter activation. Major histocompatibility complex (MHC) class II molecules’ expression important for DC functionality was also observed to be dependent of Irf8 and TF2. Moreover, our study highlighted the role of TF1 for pDC specification. Whilst not being intrinsically required, when combined with Irf8 and TF2, TF1 increases the expression of pDC- typical surface markers with the generation of tdTomato+ B220+ Bst2+ pDC-like cells by direct reprogramming. In summary, we provide evidence that Irf8 when combined with TF2 and TF1 kicks-start a pDC program in fibroblasts. These findings provide valuable insights into pDC specification. In the future, the generation of pDCs by direct reprogramming opens avenues for inducing anti-viral immune responses with autologous-engineered cells.