Retinopatia diabética : um lapso de comunicação

Abstract

As gap junctions são canais intercelulares, constituídos por hexâmeros de conexina (Cx), que permitem a passagem de iões e metabolitos entre células adjacentes. Um dos mecanismos envolvidos na regulação da comunicação intercelular por gap junctions (CIGJ) é a degradação de Cx, nomeadamente através de um processo mediado pela ubiquitina. No caso concreto da conexina 43 (Cx43), a ubiquitinação é catalisada pela Nedd4, uma ligase de ubiquitina (E3). Apesar de já ter sido demonstrado que a hiperglicémia conduz a uma degradação da Cx43, os mecanismos moleculares envolvidos neste processo continuam largamente desconhecidos. Neste trabalho investigaram-se os efeitos da hiperglicémia em células do epitélio pigmentado da retina (EPR) nos níveis de Cx43, bem como na velocidade de degradação, na ubiquitinação e localização subcelular da conexina em estudo. Em seguida investigou-se o efeito da inibição da expressão de Nedd4 nas variáveis supracitadas. Por fim verificou-se que a diminuição de Cx43 provocada pela hiperglicémia tem repercussões funcionais na CIGJ. Os resultados obtidos neste estudo mostram que a incubação de células do EPR com elevadas concentrações de glucose resulta na diminuição da quantidade total de Cx43, determinada por Western blot. A avaliação do tempo de vida da proteína mostra que a diminuição de Cx43 resulta de um aumento da sua degradação. Através de ensaios de imunoprecipitação demonstrou-se que os níveis de ubiquitinação da Cx43 aumentam em hiperglicémia. Resultados obtidos por microscopia confocal mostram que há uma redução da quantidade de Cx43 perto da membrana plasmática, assim como uma diminuição da CIGJ. No entanto, células depletadas de Nedd4, através de incubação com siRNA contra Nedd4, apresentam uma estabilização da Cx43 em hiperglicémia, quer em termos de quantidade total da proteína, quer no que respeita à sua localização na membrana plasmática Estes resultados sugerem que a ubiquitinação de Cx43 mediada por Nedd4 é um sinal para internalização e degradação de Cx43 em hiperglicémia, que poderá contribuir para as disfunções celulares observadas na retinopatia diabética.

Gap junctions (GJ) are intercellular channels which allow ion and metabolite interchange between juxtaposed cells. These channels are formed by two hemichannels, each composed of six connexin subunits anchored in each adjacent cell. Gap junction intercellular communication (GJIC) can be regulated in many different ways. Connexin 43 (Cx43) degradation is one of the most important, and also perhaps securest, instrument of GJIC regulation. Nedd4-mediated ubiquitination of Cx43 acts as an internalization and degradation signal for Cx43. This mechanism leads do GJ degradation in many cell types, however the molecular machinery involved in this process remain elusive. The main purpose of this study is to evaluate the effect of Cx43 turnover in retinal pigmented epithelium (RPE) cells incubated in high glucose (HG) conditions as well as the mechanisms and molecular apparatus involved. The data obtained shows a reduction in total levels of Cx43 in cells cultured on HG, concomitantly with a decrease in the amount of Cx43 localized at the plasma membrane. Moreover, levels of Cx43 ubiquitination are increased in HG, suggesting ubiquitin may act as a signal for degradation of Cx43. Also, Nedd4 depletion precludes Cx43 internalization and degradation in HG cultured cells, suggesting HG-induced degradation of Cx43 depends on Nedd4. These results advocate that Nedd4-mediated Cx43 ubiquitination is a signaling pathway to Cx43 internalization and/or degradation in HG conditions, possibly contributing cellular dysfunction seen in diabetic retinopathy