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Title: Avaliação dos efeitos celulares, humorais e moleculares da administração do teduglutide num modelo animal de anastomose intestinal
Other Titles: Evaluation of the cellular, humoral and molecular effects of the teduglutide administration on an animal model of intestinal anastomosis
Authors: Costa, Beatriz Maria Pinto Cruz 
Orientador: Francisco Castro, Sousa
Botelho, Filomena
Ribeiro, Ana Sarmento
Keywords: Teduglutide; Surgical anastomosis; Anastomotic leak; Reepithelialization; Physiologic angiogenesis; Extracellular matrix; Growth factor; Adult stem cells; Inflammation; Oxidative stress; Anastomose cirúrgica; Fístula anastomótica; Reepitelização; Angiogénese fisiológica; Matriz extracelular; Factor de crescimento; Células estaminais adultas; Inflamação; Stresse oxidativo
Issue Date: 27-Jun-2018
Citation: COSTA, Beatriz Maria Pinto Cruz - Avaliação dos efeitos celulares, humorais e moleculares da administração do teduglutide num modelo animal de anastomose intestinal. Coimbra : [s.n.], 2018. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/80589
Abstract: Despite recent progresses in surgical technique and perioperative care, failure of intestinal anastomotic healing remains one of the most feared complications in digestive surgery, exerting a profound adverse impact on the operative morbidity and mortality rates, oncologic, and functional outcomes and socioeconomic costs. Teduglutide is an enterotrophic analogue of glucagon-like peptide 2 (GLP-2) approved for the pharmacological rehabilitation of short-bowel syndrome. Present study aims to clarify the potential of teduglutide as a promoting strategy for the improvement of intestinal anastomotic healing, on an animal model, through the influence on the cellular, humoral and molecular mediators of repair. An experimental rat model of standard small-bowel anastomosis was used with evaluation at the third and seventh postoperative days. Structural assessment of the anastomosis included the macroscopic integrity and the histological and immunohistochemical examination of healing parameters, comprising reepithelialization, neoangiogenesis and fibroplasia. Cellular and molecular mediators of anastomotic healing were analyzed, including: putative epithelial stem cells response (using Lgr5, Bmi1 and the panel CD24/CD44/CD166/Grp78 surface markers by flow cytometry); cellular viability and death (with double staining with annexin-V/propidium iodide by flow cytometry); oxidative stress [quantification of cytosolic peroxides with 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2) probe, mitochondrial reactive species with dihydrorhodamine 123 (DHR 123) probe, total intracellular reduced glutathione with mercury orange staining and mitochondrial membrane potential with 5,5',6,6'-tethrachloro-1,1',3,3'-tethraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1) probe, by flow cytometry]; local and systemic inflammatory response (tissue and plasma concentrations of interleukine-1α, macrophage chemo-attractant protein-1, tumor necrosis factor-α, interferon-γ and interleukine-4 by flow cytometric multiplexed bead assay); gene expression of main extracellular matrix components (Collagen, type I, alpha 1: Col1a1; Collagen, type III, alpha 1: Col3a1; Collagen, type IV, alpha 1: Col4a1; Collagen, type V, alpha 1: Col5a1) and remodeling factors, matrix metalloproteinases (Mmp; Mmp1 and Mmp13, Mmp2 and Mmp9, Mmp3, Mmp12 and Mmp14) and tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2 (Timp; Timp1 and Timp2); gene expression of growth factors and receptor potentially implicated on anastomotic repair (Insulin-like growth factor 1, transcript variant: Igf1; Vascular endothelial growth factor A, transcript variant 2: Vegfa; Transforming growth factor, beta 1: Tgfb1; Connective tissue growth factor: Ctgf; Fibroblast growth factor 2: Fgf2; Fibroblast growth factor 7: Fgf7; Epidermal growth factor: Egf; Heparin-binding epidermal-like growth factor: Hbegf; Platelet-derived growth factor beta polypeptide: Pdgfb; Glucagon-like peptide 2 receptor: Glp2r) by quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR); and Glp-2 plasma levels (by competitive enzyme immunoassay). Teduglutide had no apparent relevant impact on the rate or severity of intestinal anastomotic leakage. A favorable influence of teduglutide on the reepithelialization and neoangiogenesis events of the proliferative phase of anastomotic repair was documented. Teduglutide was associated with an increase of subepithelial myofibroblasts density score, but no significant effect on the goblet, Paneth and glial cellular indexes was observed. This growth factor was associated with an enhancement of type III collagen deposition on the submucosa at the seventh postoperative day, although with simultaneous reduction of type I collagen level in that layer, and a non-significant reduction of global anastomotic collagen content. Teduglutide inhibited the gene modulation of fibrolysis in the predominantly inflammatory phase of anastomotic repair, while stimulated the fibrolysis in the proliferative stage. Teduglutide induced the upregulation of gene expression of Timp1, Timp2 and Col4a1, and the downregulation of Mmp3 and Mmp12, at the third postoperative day; and the repression of gene expression of Timp1, Col3a1, Col4a1 and Col5a1, at the seventh day. Teduglutide contributed to the expansion of the putative crypt base columnar stem cells pool at the seventh day and to the concomitant depletion of the putative “position +4” stem cells fraction. An increase (non-significant) of the overall putative intestinal epithelial stem cells was also observed in teduglutide-treated animals. Teduglutide was associated with a non-significant prooxidative effect, with an increase of the cytosolic peroxides level and mitochondrial reactive species levels and a reduction of the cellular reduced glutathione content. Those effects were coincident with an increase of cellular viability indexes and a non-significant decrease of early apoptotic events. No relevant influence on mitochondrial membrane potential was verified. A non-significant increase of tissue levels of the anti-inflammatory interleukin-4 at the seventh day, and a significant reduction of plasma levels of interferon-γ at the third day were observed in teduglutide-treated animals. Teduglutide induced the upregulation of the gene expression of Igf1, Vegfa and Ctgf and the downmodulation of Fgf2, Fgf7, Tgfb1 and Glp2r. To conclude, the present study reflects the complexity of the intestinal anastomotic repair and points to a favorable influence of teduglutide on this process that deserves additional investigation.
Apesar dos recentes progressos da técnica cirúrgica e suporte peri-operatório, a falência da cicatrização anastomótica intestinal constitui, ainda, uma das mais temíveis complicações da cirurgia digestiva, com um importante impacto adverso na mortalidade e morbilidade operatórias, resultados oncológicos e funcionais e custos económico-sociais. O teduglutide é um análogo enterotrófico do glucagon-like peptide 2 (GLP-2) aprovado para a reabilitação farmacológica da síndroma do intestino curto. Este estudo procurou analisar as potencialidades do teduglutide como estratégia adjuvante da cicatrização anastomótica intestinal, num modelo animal, através da sua influência nos mediadores celulares, humorais e moleculares do processo reparativo. Foi utilizado um modelo experimental de anastomose intestinal estandardizada, em rato, com avaliação ao terceiro e ao sétimo dias pós-operatórios. A avaliação estrutural da anastomose incluiu a integridade macroscópica e os exames histológico e imunohistoquímico dos parâmetros de cicatrização, tais como reepitelização, neoangiogénese e fibroplasia. Foram analisados os seguintes mediadores celulares e moleculares da cicatrização anastomótica: resposta das putativas células estaminais epiteliais (usando os marcadores de superfície Lgr5, Bmi1 e o painel CD24/CD44/CD166/GrpP78 por citometria de fluxo); viabilidade e morte celular (com marcação dupla com anexina V/iodeto de propídeo, por citometria de fluxo); stresse oxidativo [quantificação de peróxidos citoplasmáticos com sonda de diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (DCFH2), espécies reactivas mitocondriais com sonda de dihidrorodamina 123 (DHR 123), glutatião reduzido intracelular com marcação com alaranjado de mercúrio e potencial de membrana mitocondrial com sonda de iodeto de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina (JC-1), por citometria de fluxo]; resposta inflamatória local e sistémica (concentrações tecidulares e plasmáticas de interleucina-1α, macrophage chemo-attractant protein-1, factor de necrose tumoral-α, interferon-γ e interleucina-4 por citometria de fluxo; expressão génica de componentes da matriz extracelular (Collagen, type I, alpha 1: Col1a1; Collagen, type III, alpha 1: Col3a1; Collagen, type IV, alpha 1: Col4a1; Collagen, type V, alpha 1: Col5a1) e respectivos factores de remodelação, metaloproteinases (Mmp) da matriz 1, 13, 2, 9, 3, 12 e 14 (Mmp1 e Mmp13, Mmp2 e Mmp9, Mmp3, Mmp12 e Mmp14) e inibidores tecidulares das Mmp 1 e 2 (Timp1 and Timp2); assim como dos factores de crescimento potencialmente implicados na reparação anastomótica (Insulin-like growth factor 1, transcript variant: Igf1; Vascular endothelial growth factor A, transcript variant 2: Vegfa; Transforming growth factor, beta 1: Tgfb1; Connective tissue growth factor: Ctgf; Fibroblast growth factor 2: Fgf2; Fibroblast growth factor 7: Fgf7; Epidermal growth factor: Egf; Heparin-binding EGF-like growth factor: Hbegf; Platelet-derived growth factor beta polypeptide: Pdgfb; Glucagon-like peptide 2 receptor: Glp2r) por transcrição reversa quantitativa da reacção em cadeia da polimerase em tempo real; e da concentração plasmática do Glp-2 (por imunoensaio enzimático competitivo). O teduglutide não teve impacto relevante aparente na incidência e gravidade da deiscência anastomótica mas exerceu uma influência favorável nos processos de reepitelização e de neoangiogénese da fase proliferativa da cicatrização. Associou-se, ainda, a um aumento da densidade de miofibroblastos subepiteliais, sem modificação significativa dos índices de células caliciformes, de Paneth e gliais. Este factor de crescimento associou-se ao aumento da deposição de colagéneo III na submucosa ao sétimo dia pós-operatório, embora com redução concomitante do colagéneo I na mesma camada, e à redução não significativa do teor global de colagéneo na anastomose. O teduglutide inibiu a modulação génica da fibrólise na fase predominantemente inflamatória da reparação enquanto, pelo contrário, reprimiu a fibrogénese na fase proliferativa. O teduglutide aumentou a expressão génica de Timp1, Timp2 e Col4a1 e, reduziu a de Mmp3 e Mmp12, ao terceiro dia pós-operatório; e diminuiu a expressão génica do Timp1, Col3a1, Col4a1 e Col5a1, ao sétimo dia. O teduglutide induziu a expansão das putativas células estaminais colunares basais das criptas e, concomitantemente, a depleção das células da “posição +4”. Nos animais tratados com teduglutide, observou-se, ainda, um aumento global não significativo das putativas células epiteliais intestinais. O teduglutide associou-se a um efeito pro-oxidativo não significativo, com aumento dos níveis de peróxidos citoplasmáticos e das espécies reactivas mitocondriais e redução do glutatião reduzido celular. Estes efeitos foram acompanhados por um aumento do índice de viabilidade celular e uma redução não significativa dos eventos apoptóticos precoces. Não se verificou influência significativa no potencial de membrana mitocondrial. Nos animais tratados com teduglutide, observou-se um aumento não significativo dos níveis tecidulares da citocina anti-inflamatória interleucina-4 ao sétimo dia, assim como uma redução significativa da concentração plasmática de interferon-γ ao terceiro dia. O teduglutide promoveu o aumento da expressão génica do Igf1, Vegfa e Ctgf e a repressão do Fgf2, Fgf7, Tgfb1 e Glp2r. Em conclusão, o presente estudo reflecte a complexidade da cicatrização anastomótica intestinal e sugere uma influência favorável do teduglutide neste processo que justifica uma investigação adicional.
Description: Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Medicina, na especialidade de Cirurgia, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/80589
Rights: openAccess
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