Apoptosis modulation : new therapaeutic targerts in B cell hematologic lymphomas

Abstract

Cancer is a multifactorial disease resulting from the accumulation of various molecular alterations that can affect proliferation, differentiation and apoptosis. TRAIL (TNF-Related Apoptotic Inducing Ligand), also known as APO2L, can bind and interact with five different receptors: TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, and osteoprotegerin. The binding of TRAIL to R1 and R2 induces apoptosis by caspase activation, while binding to anti apoptotic receptors R3 and R4 can inhibit apoptosis and lead to chemotherapy resistance. Furthermore, the sensitivity to apoptosis is related to the level of caspase inhibitory proteins, IAP (Inhibitors of Apoptosis Proteins) such as survivin. Despite the great advances in therapy to improve the treatment of hematologic malignancies, mortality rate remains high and, consequently, the demand for more effective and specific cancer therapeutics remains a priority. The objective of this work is to study the therapeutic potential of recombinant human TRAIL (rhTRAIL) and survinin inhibitors, silibinin (SLB) and gambogic acid (GA) in B cell malignancies, specifically in chronic lymphocytic leukemia (CLL-B) and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). For this purpose CLL-B (EHEB cells) and DLBCL (Farage cells) cell lines were incubated in the absence and presence of increasing concentrations of rhAPO2L/TRAIL, SLB and GA, in monotherapy. Cell viability was analyzed by trypan blue assay. Cell death was analyzed by optical microscopy (May-Grünwald-Giemsa), and flow cytometry (annexinV/propidium iodide). Expression of survivin, TRAIL ligand and its receptors was assessed by flow cytometry using monoclonal antibodies labelled with fluorescent probes. Our results show that rhTRAIL, GA and SLB, induced a decreased on cell viability in a dose, time and cell type dependent manner inducing cell death mainly by apoptosis. In EHEB cells, the IC50 after 24h of incubation with GA was obtained in a range of concentrations between 750 nM to 1000 nM, and of SLB with 100 µM to 150 µM. On the other hand, in FARAGE cells, IC50 of GA was achieved at 24h of incubation at lower concentrations (between 300nM and 400nM), and with SLB at 48h (100µM). Although IC50 wasn´t obtained with rhTRAIL in both cell lines. These results may be related with the increased ratio between pro- and anti- apoptotic TRAIL receptors, the activation of intrinsic, extrinsic, or both, apoptotic pathways, and the decreased survivin expression. Our preliminary study suggests that rhTRAIL, silibilin and gambogic acid can be used as a new therapeutic approach in the treatment of Diffuse large B-cell Lymphoma and in Chronic Lymphocytic Leukemia as singles agents, but in order to improve treatment efficacy, combination of these agents must be tested. The optimized combination may reduce toxicity and side effects, and eventually overcome treatment failure and drug resistance.

O cancro é uma doença multifatorial que resulta da acumulação de várias alterações moleculares que afetam a proliferação, a diferenciação e a apoptose celular. O TRAIL (TNF Related Apoptotic Inducing Ligand), ou APO2L, pode ligar-se e interagir com cinco tipos de recetores: TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, e a osteoprotegerina. A ligação do TRAIL aos recetores R1 e R2 induz apoptose pela ativação das caspases, enquanto que a ligação aos recetores anti-apoptóticos, R3 e R4, pode inibi-la, tornando as células resistentes à terapêutica. Além disso, a sensibilidade de uma célula à apoptose pode estar relacionada com o nível de proteínas inibidoras das caspases, as IAP (Proteínas Inibidoras da Apoptose), como a survivina. Apesar dos grandes avanços nas últimas décadas no sentido de melhorar o tratamento das neoplasias hematológicas, a taxa de mortalidade permanece elevada, pelo que a procura de terapêuticas mais eficazes e dirigidas à célula cancerígena continua uma prioridade. O objetivo deste trabalho é estudar o potencial terapêutico do rhTRAIL e dos inibidores da survinina, nomeadamente da silibinina e do ácido gambógico em tumores de células B, especificamente na Leucemia Linfocítica Crónica (LLC-B) e no Linfoma Difuso de Grandes Células B (LDGC-B). Para o efeito linhas celulares de LLC-B (as células EHEB) e de LDGB (as células FARAGE) foram incubadas na ausência e na presença de concentrações crescentes de rhTRAIL, de silibinina (SLB) e ácido gambógico (GA), em monoterapia. A proliferação e viabilidade celular foram determinadas pelo teste de exclusão do azul de tripano. A morte celular foi analisada por microscopia ótica (May-Grünwald-Giemsa), e por citometria de fluxo (AnexinaV/Iodeto de propídeo). A expressão do TRAIL ligando e dos seus recetores e da survivina, foi avaliada por citometria de fluxo, com anticorpos marcados com sondas fluorescentes. Os resultados mostram que o rhTRAIL, a silibinina e o acido gambógico, induzem uma diminuição na viabilidade celular, dependente da dose, do tempo de incubação e do tipo celular, predominantemente por apoptose. Na linha celular EHEB o IC50 5

foi obtido com o GA entre as concentrações de 750 nM e 1000 nM e com a SLB entre 100 uM e 150 uM, após 24 horas de incubação. Por outro lado, nas células FARAGE, o IC50 com o GA, foi obtido após 24 de incubação em doses mais baixas (entre 300 nM e 400 nM), e com a SLB após 48h com a concentração de 100 uM. Contudo IC50 não foi atingido em nenhuma linha celular com o rhTRAIL. Estes resultados podem dever-se ao aumento da razão entre os recetores pró- e anti- apoptóticos, à ativação da via intrínseca, da via extrínseca ou ambas, e à diminuição da expressão da survivina. O nosso estudo preliminar sugere que o rhTRAIL, a silibinina e o acido gambógico podem ser usados, em monoterapia, como novos potenciais terapêuticos no tratamento da Leucemia Linfocítica Crónica e do Linfoma Difuso de Grandes Células B. Contudo, de forma a melhorar a eficácia do tratamento a combinação deve ser testada. A combinação pode reduzir a toxicidade e os efeitos colaterais, e, eventualmente, ultrapassar o fracasso e a resistência ao tratamento.