Potencial terapêutico da cymbopogon citratus na leucemia promielocítica aguda

Abstract

A Cymbopogon citratus é uma planta nativa da Índia e as suas folhas são utilizadas na gastronomia tradicional, consumidas como uma bebida aromática e utilizadas na medicina popular. Os extratos desta planta demonstraram, entre outras, atividade antioxidante podendo ser utilizadas na prevenção do cancro. Contudo, o seu potencial terapêutico no cancro não está esclarecido. Assim, com este trabalho pretende-se estudar o potencial terapêutico do C. citratus em leucemias, nomeadamente na Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA), assim como alguns dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade. Para o efeito, as células HL-60, obtidas de um doente com LPMA, foram cultivadas na ausência e na presença de vários extratos polifenólicos de uma infusão de C. citratus, a diferentes concentrações e por diferentes períodos de tempo. A proliferação e a viabilidade celular foram avaliadas pelo IC50 recorrendo ao teste do azul de tripano. O tipo de morte celular foi analisado por microscopia ótica e citometria de fluxo (CF) com anexina V e IP. Alguns dos mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade induzida pela C. citratus foram avaliados por CF nomeadamente a expressão das proteínas reguladoras da apoptose, as proteínas BCL-2, BAX, FAS, FAS ligando, Caspase 3 e p53. A participação da mitocôndria e do stress oxidativo foi analisada por CF, através da determinação do potencial de membrana mitocondrial (ψmit) recorrendo à sonda fluorescente JC1, pela produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) utilizando as sondas DCFH2-DA e DHE, e dos níveis de glutatião reduzido (GSH) através do Alanjado de Mercúrio. Os nossos resultados preliminares mostram que a infusão desta planta induz diminuição na viabilidade das células HL-60, de modo dependente da concentração, do tempo de incubação, e da fração polifenólica, com IC50 entre 50 e 250 mg/ml, após 48h de incubação. A apoptose observada pode ser mediada pelo aumento de caspase 3 e FAS ligando. Estes resultados 4 foram confirmados por microscópia ótica, observando características morfológicas típicas de morte celular por apoptose. Por outro lado, estes compostos induzem aumento da expressão intracelular de anião superóxido, diminuição da expressão de GSH e perda de potencial de membrana mitocondrial, sendo estes efeitos dependentes do tipo de fração. Assim, o nosso estudo sugere que os extratos polifenólicos da infusão de C. citratus poderão ser uma nova opção terapêutica na LPMA.

Cymbopogon citratos is a native herb from India and its leaves are used in traditional cuisine, as aromatic drinks and in popular medicine. Extracts from this herb leaves have demonstrated, among others properties, efficiency against oxidative damage that could be used in cancer prevention. However, the therapeutic potential in cancer is not clear. Therefore, the aim of this work is to evaluate the potential therapeutic of C. citratus in Leukemia, in particular Acute Promyelocytic Leukemia (APL), and understand some of the cytotoxic mechanisms involved. For this purpose, HL-60 cell line, obtained from an APL patient, was cultured in absence and presence of C. citratus initial infusion and several polyphenolic extracts, for different periods of time. Cell growth and viability were evaluated by the Trypan Blue assay and the efficacy of the drugs determined by the IC50. Cell death analysis was performed by morphological studies and by flow cytometry (FC), using annexin-V/propidium iodide incorporation. The mechanisms involved in C. Citratus cytotoxicity were analyzed by flow cytometry through the expression of proteins involved in apoptotic pathways, namely BCL-2, BAX, FAS, FAS ligand, Caspase 3 and p53. The mitochondria function and oxidative stress evaluation were analyzed by FC, through the determination of mitochondria membrane potential (ψmit) using JC1 fluorescent probe, by the ROS production using DCFH2-DA e DHE fluorescent probe, and GSH levels using the Mercury Orange fluorescent probe. Our preliminary results show that C. citratus induces a decrease in HL-60 cell viability in a dose, time and fraction composition dependent manner, with an IC50 values ranging from 50 to 250 μg/ml, after 48h of incubation. Caspase 3 and Fas ligand may be involved in apoptotic cell death. 6 The results were confirmed by optic microscopy with observation of apoptotic cell death morphologic changes. In the other hand, these compounds induce increasing superoxide anion expression, decreasing GSH levels and loss of mitochondria membrane potential, in a fraction composition dependent manner. In summary, C. citratus polyphenolic extracts may be a new therapeutic option for treatment of APL.