Strategies to reverse cellular senescence and enhance progerin clearance in Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome

Abstract

Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS), a lethal genetic disorder, is characterized by premature accelerated aging. HGPS children have short stature, low body weight, lipodystrophy, alopecia, skin and bone abnormalities, and atherosclerosis. The cardiovascular system is severely affected and, in most of the cases, children succumb to myocardial infarction or stroke in their early teens, at an average age of 14.6. HGPS is most commonly caused by a de novo point mutation (G608G) within the lamin A/C gene (LMNA) that partially activates a cryptic splice donor site in exon 11, producing an abnormal lamin A protein termed progerin. This truncated abnormal Lamin A does not undergo the normal proteolytic processing, becoming permanently farnesylated, which alters lamins dynamics and their association with the inner nuclear membrane. Accumulation of progerin causes nuclear abnormalities, mitotic abnormalities and cell cycle arrest, ultimately leading to cellular senescence, and therefore, is one of the mechanisms underlying the progression of HGPS. Several therapeutic strategies have been developed in the last years for HGPS targetting progerin processing or its turnover. In fact, a recent study showed that treatment with rapamycin stimulated autophagy in HGPS cells, resulting in enhanced progerin clearance, reduced nuclear blebbing and postponed cellular senescence. Rapamycin, a macrolide antibiotic, is a well-established autophagy inducer, by inhibiting MTOR activity, the canonic molecular switch for autophagy induction. In fact, rapamycin is known to extend longevity in several organisms, including mammals, and this effect is at least in part dependent of autophagy activation. Although rapamycin treatment has been considered as a therapeutic strategy for HGPS, the substantial set of rapamycin-associated adverse effects, as well as the lack of aging-specific human data, should caution the routine use of rapamycin as an anti-aging agent. The identification of safer stimulators of autophagy, with other beneficial effects, for chronic treatment of HGPS patients is of utmost importance. Ghrelin is 28 amino acid acylated peptide initially identified in the rat stomach as the endogenous ligand for the growth hormone secretagogue-receptor (GHS-R1). Ghrelin is a circulating hormone with multiple functions that has been shown to be beneficial in organs/cells affected by HGPS. It is envolved in growth hormone secretion, regulation of energetic and metabolic balance, regulation of cardiovascular functions (increase of cardiac output, decrease blood flow, protection against cardiac damage, antiapoptotic effects), bone remodeling (increase osteoblast differentiation and bone mineral density), inflammation (suppressing the production of cytokines), glucose metabolism, protection from ischemia/reperfusion injury as well as improving the prognosis of myocardial infarction and heart failure. Of importance, ghrelin and ghrelin analogues have been assessed in several clinical trials for the treatment of other diseases such as cachexia in chronic heart failure, anorexia nervosa and growth hormone deficiency-related disorders. Being an endogenous and ubiquitously expressed hormone it has been proposed that ghrelin and its receptor can act positively in HGPS pathology and treatments with exogenous ghrelin promises a strategy to delay or block the premature aging of HGPS and potentially to increase lifespan. In line with this, the main goal of this study was to investigate the role of ghrelin in rescuing the aging phenotype of HGPS-patients derived cells. In this study, primary human dermal fibroblasts cell cultures from HGPS patients were used. HGPS fibroblasts were treated with human ghrelin (1 nM) for 1 week and the effect of ghrelin on progerin accumulation and several hallmarks of cellular aging, such as loss of proteostasis, nuclear abnormalities, DNA damage and cellular senescence were evaluated. In HGPS cells, ghrelin decreased by 50 % progerin protein levels. As we observed no alterations on progerin mRNA levels, we next evaluated whether ghrelin decreased progerin levels through protein degradation. In fact, we observed that ghrelin increased autophagic flux in HGPS cells, supporting that ghrelin enhanced progerin degradation in HGPS cells. Concomitant with progerin clearance, ghrelin decreased the number of dysmorphic nuclei, a hallmark of HGPS cells, increased nuclear circularity and decreased nuclear area, rescuing nuclear morphology in HGPS cells. Ghrelin also decreased DNA damage in HGPS cells, as shown by a reduction in the number of γH2AX foci, a marker of DNA damage. In addition, ghrelin increased HGPS cells proliferative capacity, as determined by an increase in the number of Ki-67-positive cells, a marker of cell proliferation. Moreover, ghrelin decreased senescence-associated-beta-galactosidase (SA-beta-Gal) activity. Fewer SA-beta-Gal–positive cells were observed in ghrelin-treated cells, indicating that ghrelin slowed down the progression of cellular senescence in HGPS cells. In conclusion, our study shows that ghrelin treatment i) decreases progerin levels, probably through autophagy stimulation, ii) rescues nuclear abnormalities, iii) decreases DNA damage, iv) increases cell proliferation, and v) delays cellular senescence in HGPS cells. Altogether, these results show that ghrelin rescues the senescent phenotype of HGPS cells and strongly support that ghrelin can be considered a promising strategy to delay or block the premature aging of HGPS.

A Progeria, também conhecida como sindrome de Hutchinson-Gilford (HGPS) é uma doença genética extremamente rara e fatal, estimando-se que afecte 1 em cada 4 a 8 milhões de nascimentos, em todo o mundo. Esta doença afecta ambos os sexos e todas as raças de igual forma. Esta doença caracteriza-se por um envelhecimento acelerado e prematuro. As crianças com esta síndrome nascem aparentemente saudáveis e só começam a evidenciar sintomas de envelhecimento prematuro entre os 18 e os 24 meses, apresentando uma taxa de crescimento reduzida, baixa estatura, baixo peso corporal, lipodistrofia, alopécia, anomalias a nível da pele e do osso e aterosclerose. O sistema cardiovascular é severamente afectado e, na maior parte dos casos, as crianças morrem devido a enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral com uma idade média de 14.6 anos. A HGPS é uma doença genética autossómca dominante causada, principalmente, por uma mutação pontual de novo (G608G) no exão 11 do gene que codifica a lamin A/C (LMNA) activando parcialmente um local de splicing alternativo, levando à síntese de uma proteína Lamina A truncada designada por progerina. Esta proteína truncada não é processada normalmente tornando-se permanentemente farnesilada, alterando a organização das laminas no envelope nuclear e a sua associação à membrana nuclear interna. A acumulação de progerina causa alterações na morfologia nuclear e divisão celular levando, em última instância à senescência celular, um dos mecanismos subjacentes à progressão da HGPS. Várias estratégias terapêuticas têm vindo a ser desenvolvidas nos últimos anos para o tratamento da HGPS, focadas na inibição da farnesilação da progerina ou na sua degradação. Um estudo recente mostrou que o tratamento com rapamicina aumenta a autofagia em células HGPS, com a consequente degradação da progerina, melhoria da morfologia nuclear e retardamento da senescência celular. A rapamicina, um antibiótico macrólido, é um indutor da autofagia, através da inibição da actividade do MTOR, o interruptor molecular da via canónica para a indução autofagia. De facto, a rapamicina aumenta a longevidade em vários organismos, incluindo mamíferos, e este efeito é, pelo menos em parte, dependente da activação da autofagia. Embora o tratamento com rapamicina esteja a ser considerado como uma estratégia terapêutica para HGPS, os efeitos adversos associados ao tratamento com rapamicina, bem como a falta de dados em humanos no contexto do envelhecimento, sugerem cautela na adminstração crónica de rapamicina como um tratamento para retardar ou bloquear o envelhecimento. A identificação de fármacos indutores de autofagia, sem efeitos adversos, para o tratamento crónico de HGPS é por esta mesma razão, de extrema importância. A grelina é um péptido com 28 aminoácidos e foi descrita inicialmente no estômago do rato sendo o ligando endógeneo para o recetor dos secretagogos da hormona de crescimento (GHS-R1a). A grelina é uma hormona periférica com múltiplas funções que têm vindo a ser demonstradas como benéficas em orgãos/células afetados pela HGPS. A grelina está envolvida na secreção da hormona de crescimento, no equílibrio energético e metabolismo, na regulação das funções cardiovasculares (no aumento do débito cardíaco, na diminuição do fluxo sanguíneo, na proteção contra danos cardíacos, com efeitos antiapoptóticos), na remodelação óssea (no aumento da diferenciação de osteoblastos e na densidade óssea mineral), e na inflamação (suprimindo a produção de citocinas), no metabolismo da glucose, na proteção isquémica, melhorando o prognóstico de enfarte do miocárdio e da insuficiência cardíaca. É de salientar que a grelina e os seus analógos têm vindo a ser testados em ensaios clínicos para o tratamento de outras doenças humanas como caquexia, anorexia nervosa e doenças relacionadas com deficiências na hormona de crescimento. Sendo uma hormona endógenea expressa de forma ubíqua e tendo efeitos positivos em doenças associadas à HGPS, a grelina e o seu receptor podem ser considerados como alvos promissores para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para atrasar ou bloquear o envelhecimento prematuro que caracteriza a HGPS, aumentando a qualidade de vida e a esperança média de vida dos doentes com HGPS. Assim, o principal objetivo deste estudo foi investigar o potencial terapêutico da grelina em retardar o envelhecimento prematuro que caracteriza a HGPS. Neste estudo foram usadas culturas primárias de fibroblastos da derme de doentes com HGPS, um modelo experimental frequentemente utilizado em estudos sobre esta patologia. As células foram tratadas com grelina (1 nM) durante uma semana e foi avaliado o efeito desta na acumulação de progerina e em diversas outras caracteristicas associadas ao envelhecimento celular como alteração da morfologia nuclear, danos no ácido desoxirribonucleico ADN, perda de proteostase e senescência celular. Este estudo mostra que o tratamento com grelina diminui em cerca de 50% os níveis de progerina nos fibroblastos de doentes com HGPS. Como não foram observadas alterações nos níveis de mRNA da progerina, avaliou-se de seguida se a dimnuição nos níveis proteicos de progerina se deveriam a um aumento da degradação proteica, através da indução de autofagia. De facto, a grelina induz autofagia e aumenta o fluxo autofágico nos fibroblastos de doentes com HGPS, o que sugere que a grelina índuz a degradação de progerina nestas células. Concomitante com a degradação de progerina, a grelina diminuiu o número de núcleos dismórifcos, uma característica proeminente das células HGPS, o que se relaciona com um aumento na circularidade nuclear e diminuição da área nuclear, havendo uma melhoria na morfologia nuclear das células HGPS. A grelina também diminuiu os dano no ADN, demonstrado por uma redução no número de foci de γH2AX, um marcador de danos no ADN. Para além disso, a grelina aumentou a capacidade proliferativa das células e diminuiu a actividade da beta galatosidade associada à senescência demonstrando que a grelina reduz a progressão da senescência celular dos fibroblastos de HGPS.