Avaliação do potencial terapêutico do Acanthus mollis

Abstract

O Acanthus mollis é uma planta nativa da região mediterrânica pertencente a uma extensa família (Acanthaceae) que compreende 4300 espécies distribuídas principalmente em regiões tropicais (Rezanka, Rezanka e Sigler, 2009), sendo tradicionalmente usada externamente como cicatrizante de feridas e queimaduras, analgésico e anti-inflamatório, e internamente como diurético, anti-inflamatório e calmante das mucosas do trato digestivo e urinário. Os estudos sobre a composição fitoquímica são escassos, assim como a comprovação científica da eficácia em patologias referidas na medicina popular. Em face do exposto e considerando o atual interesse na procura de novos produtos de origem natural com atividade terapêutica e destituídos de toxicidade, este trabalho aborda a caracterização fitoquímica e a avaliação do potencial terapêutico do Acanthus mollis, com base no estudo das propriedades biológicas que suportem algumas das suas utilizações tradicionais. Através da combinação de diversos processos extrativos foram obtidos diferentes extratos naturais a partir de folhas de Acanthus mollis. Assim, após secagem das folhas, por liofilização, efectuou-se uma extração sequencial, com éter petróleo, clorofórmio, etanol, etanol a 50% e água. Adicionalmente, foram preparados dois extratos aquosos, infusão e decocção. Os extratos obtidos foram analisados recorrendo a técnicas de cromatografia em camada fina para pesquisa de flavonóides, saponinas, triterpenos, alcalóides, taninos e benzoxazinóides. Estes mesmos extratos foram posteriormente analisados por cromatografia líquida de alta resolução com deteção de fotodíodos, permitindo detetar a existência de ácidos fenólicos, flavonóides e benzoxazinóides, em quase todos os extratos. A pesquisa de compostos com atividade captadora do radical DPPH nos extratos foi realizada pela técnica bio-autográfica. Os extratos de éter petróleo e etanol exibiram a presença de compostos mais reativos ao DPPH, justificando a avaliação da sua atividade antioxidante. De entre estes, o extrato etanólico foi o que apresentou maior atividade anti-radicalar (IC50 20,50 ± 0,47 μg/mL; TEAC de 6,90 ± 0,90 μg/mL). O potencial anti-inflamatório foi determinado para os 3 extratos aquosos, assim como para o extrato alcoólico e hidroalcoólico, usando macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS. O infuso e o extrato etanólico exibiram maior capacidade inibitória do mediador inflamatório NO, sem evidenciar citotoxicidade nas concentrações eficazes. A maior atividade antioxidante e anti-inflamatória do extrato etanólico, evidenciada nos estudos preliminares, orientou este trabalho para uma posterior identificação de fitoconstituintes eventualmente responsáveis por essas bioatividades. Consequentemente, procedeu-se ao fracionamento deste extrato por recurso à cromatografia líquida “Flash”, em fase reversa. As frações obtidas foram monitorizadas por HPLC-PDA tendo sido selecionada uma fração contendo benzoxazinóides para a determinação da atividade antioxidante e anti-inflamatória. Esta fração evidenciou uma atividade antioxidante (IC50 de 163,02 ± 3,04 μg/mL; TEAC de 79,33 ± 0,99) inferior à do extrato etanólico, tendo no entanto exibido uma elevada atividade anti-inflamatória em macrófagos RAW 264.7 estimulados pelo LPS (IC50 de 32,32 μg/mL), sem citotoxicidade. Estes resultados sugerem que estes fitoconstituintes podem ser em parte responsáveis pela atividade anti-inflamatória que tradicionalmente se atribui a A. mollis. Neste estudo o Acanthus mollis revelou ser uma boa fonte de compostos bioativos com potencial antioxidante e anti-inflamatório para a indústria farmacêutica. Nesta perpectiva procurou-se aplicar um processo extrativo que fosse industrialmente mais viável, utilizando-se a extração com etanol a 95%, diretamente da planta seca. Este método demonstrou ser eficiente na extração dos derivados benzoxazinóides (glicósidos do DIBOA) e de fenilpropanóides (verbascósido e seus derivados), identificados por TLC, HPLC-PDA e HPLC-PDA-MSn. O extrato evidenciou uma boa atividade captadora do radical DPPH (IC50 40,00 ± 1,59 μg/mL; TEAC 23,54 ± 1,10) e do anião superóxido (IC50 de 29,42 ± 1,99 μg/mL) e baixa atividade captadora para o radical hidroxilo. O extrato apresentou também atividade anti-inflamatória em culturas de macrófagos RAW 264.7 estimuladas pelo LPS, com um IC50 deste extrato de 28,01 μg/mL, superior à atividade do extrato etanólico resultante da extração sequenciada (IC50 48,31 μg/mL), sem evidenciar citotoxicidade apreciável. Dos resultados obtidos infere-se que um extrato alcoólico de Acanthus mollis pode constituir uma importante fonte de fitoconstituintes bioativos, com importante potencial na prevenção e/ou tratamento de patologias associadas a processos oxidativos e inflamatórios.

The Acanthus mollis is a plant native to the Mediterranean region that belongs to an extended family (Acanthaceae) comprising 4300 species distributed mainly in tropical regions, being traditionally used externally as healing of wounds and burns, analgesic and anti-inflammatory and internally as a diuretic, anti-inflammatory and soothing mucosa of the digestive and urinary tract. Studies on the phytochemical composition are scarce, and the scientific evidence of efficacy in diseases mentioned in folk medicine. In view of the above and considering the current interest in the search for new natural products with therapeutic activity and devoid of toxicity, the proposed work aims to address the phytochemical characterization and evaluation of the therapeutic potential of Acanthus mollis, based on the study of biological properties that support traditional uses. By combining various extractive processes, different natural extracts were obtained from the leaves of Acanthus mollis. Thus, after drying the leaves by lyophilization, a sequential extraction was carried out with petroleum ether, chloroform, ethanol, 50% ethanol and water. Additionally, two aqueous extracts, infusion and decoction were prepared. The extracts were analyzed using thin layer chromatography techniques for searching flavonoids, saponins, triterpenes, alkaloids, tannins and benzoxazinoids. The same extracts were subsequently analyzed using high resolution liquid chromatography with photodiode array detection, allowing to detect the existence of phenolic acids, flavonoids and benzoxazinoids in almost all the extracts. The search for compounds with DPPH scavenging activity in the extracts was performed by bio-autographic technique. The petroleum ether and ethanol extracts showed the presence of more reactive compounds to DPPH, justifying the posterior evaluation of their antioxidant activity. Among these, the ethanol extract showed the highest scavenging activity (IC50 20,50 ± 0.47 μg/mL; TEAC of 6,90 ± 0,90 μg/mL). The anti-inflammatory potential was determined for the three aqueous extracts, as well for the alcoholic and hydroalcoholic extracts, using RAW 264.7 macrophages stimulated with LPS. The infusion and ethanol extract exhibited higher inhibitory capacity of the inflammatory mediator NO, with no evidence of cytotoxicity in effective concentrations. The highest antioxidant and anti-inflammatory activity of the ethanol extract, shown in preliminary studies, oriented this work for later identification of phytochemicals, possibly responsible for these bioactivities. Consequently, this extract was fractionated using reversed phase liquid "Flash"chromatography. The obtained fractions were monitored by HPLC-PDA having been selected a fraction containing benzoxazinoids to determine the antioxidant and anti-inflammatory activity. This fraction showed an antioxidant activity (IC50 of 163,02 ± 3,04 μg/mL; TEAC of 79,33 ± 0,99) lower than the ethanol extract, but nevertheless displayed a high antiinflammatory activity in RAW 264.7 macrophages stimulated by LPS (IC50 32,32 μg/mL) without cytotoxicity. These results suggest that these phytochemicals may be partly responsible for the anti-inflammatory activity that traditionally attributed to A. mollis. In this study the Acanthus mollis proved to be a good source of bioactive compounds with antioxidant and anti-inflammatory potential for the pharmaceutical industry. In this perspective we tried to apply an extraction process that would be more industrially feasible, using extraction with 95% ethanol, directly from the dried plant. This method proved to be efficient extracting benzoxazinoid derivatives (DIBOA glycosides) and phenylpropanoids (verbascosid and its derivatives), identified by TLC, HPLC-PDA and HPLC-PDA-MSn. The extract showed a good scavenging activity for DPPH (IC50 40,00 ± 1.59 μg/ml; TEAC 23,54 ± 1,10) and superoxide anion (IC50 of 29,42 ± 1.99 μg/mL) and low activity for scavenging hydroxyl radical. The extract also showed anti-inflammatory activity in RAW 264.7 macrophage cultures stimulated by LPS, with an IC50 of 28,01 μg/mL, greater than the activity of the ethanolic extract resulting from sequential extraction (IC50 48,31 μg/mL) without evidencing significant cytotoxicity. From the results obtained it appears that an alcoholic extract of Acanthus mollis could be an important source of bioactive phytochemicals, with significant potential in the prevention and/or treatment of diseases associated with oxidative and inflammatory processes.