Alterações da motilidade gástrica na diabetes mellitus tipo II : o efeito dos agonistas do recetor do glucagon-like peptide I (GLP-IRA)

Abstract

O glucagon-like peptide I (GLP-1) corresponde a um dos principais, e mais recentes, alvos terapêuticos para o tratamento da Diabetes Mellitus tipo II, pois desempenha várias funções metabólicas benéficas para o tratamento desta patologia, tais como, a potenciação da secreção de insulina induzida pela entrada de nutrientes no organismo (“efeito incretina”), a estimulação da biossíntese de insulina, a inibição da secreção de glucagina e a melhoria da função das células beta-pancreáticas. O GLP-1 é também caraterizado por promover cardioproteção, induzir a saciedade, inibir o esvaziamento gástrico e a secreção ácida gástrica, e ainda, inibir a motilidade gastrintestinal através da ativação de recetores (GLP-1R) presentes em neurónios entéricos e por via da libertação de óxido nítrico. Têm sido desenvolvidos novos fármacos agonistas do recetor do GLP-1 (GLP-1RA) que mimetizam os efeitos do agonista endógeno e que são resistentes à degradação enzimática pela DPP-IV. Os GLP-1RA também têm sido aplicados na terapêutica da obesidade devido ao efeito significativo desta classe farmacológica na inibição do apetite e consequente perda de peso. O objetivo deste projeto consistiu no estudo do efeito dos GLP-1RA, GLP-1 e Liraglutido, sobre a motilidade gástrica e de que forma esta está alterada na presença da diabetes tipo II. Para esse fim, foram usadas tiras de fundo de estômago isolado de ratos Wistar (grupo controlo) e Goto-Kakizaki (rato GK, modelo animal diabético do tipo II não obeso), com dezasseis semanas de idade, para a realização de estudos funcionais de registo da contração isométrica de curvas cumulativas concentração-resposta (CR) dos GLP-1RA (0,05 nM - 111,1 nM) após pré-contração com carbacol 5 μM. Ambos os GLP-1RA induziram contração tónica, não colinérgica e dependente da concentração, sendo que o GLP-1 foi mais eficaz na indução da contração de fundo gástrico isolado de rato GK comparativamente ao rato Wistar, enquanto os dois GLP-1RA foram equivalentes no rato Wistar. Por outro lado, o Liraglutido foi o mais potente nos animais controlo, sendo que ambos os GLP-1RA foram equipotentes nos animais diabéticos. Comparando ambos os modelos animais, o GLP-1 foi mais eficaz em rato diabético (comparado com rato Wistar). Este aumento de eficácia da resposta contrátil ao agonista endógeno pode relacionar-se com a tendência para o aumento da expressão do GLP-1R observada por Western Blotting em lisados de fundo de estômago isolado de rato GK. O aumento da expressão do recetor pode ser promovido pela patologia como mecanismo compensatório, uma vez que foi comprovada anteriormente por outro grupo de investigadores a diminuição dos níveis plasmáticos e pós-prandiais de GLP-1 em rato GK (comparado com o rato Wistar). Para a caracterização farmacológica da resposta contrátil aos GLP-1RA, realizaram-se segundas curvas CR ao GLP-1 em tiras de estômago de ratos Wistar, na presença e na ausência de 300 nM de Exendin-3 (antagonista seletivo do recetor do GLP-1) e curvas cumulativas CR ao Liraglutido na presença e na ausência de 250 M de NG-nitro-L-arginina (L-NNA, inibidor não seletivo da sintase do óxido nítrico), ambos adicionados ao banho de órgãos trinta minutos antes da execução das curvas. Na presença do antagonista Exendin-3, foi observada uma redução estatisticamente significativa (p <0,05) de 55% do efeito máximo de contração induzida pelo GLP-1, sem alteração da potência, concluindo-se que a resposta contrátil aos GLP-1RA é mediada parcialmente pelo seu recetor específico. Na presença do inibidor L-NNA, não foram observadas alterações estatisticamente significativas na resposta contrátil ao Liraglutido, e portanto, esta não parece ser dependente da sintase do óxido nítrico. Procurando compreender melhor o observável efeito contráctil dos GLP-1RA na nossa preparação, procedeu-se à avaliação do efeito do Liraglutido no relaxamento induzido por um dador de óxido nítrico, o nitroprussiato de sódio e pela noradrenalina, em tiras de fundo de estômago isoladas a partir de ratos Wistar e ratos GK tratados com o fármaco. Para tal, animais com catorze semanas de idade foram divididos em quatro grupos: ratos Wistar e ratos GK administrados com Liraglutido (200 μg/kg s.c.), duas vezes por dia e durante catorze dias; paralelamente ratos Wistar e ratos GK foram administrados com soro fisiológico NaCl 0,9% (grupo controlo). Foram realizadas medições diárias do peso corporal e a ingestão calórica foi avaliada semanalmente. Os parâmetros bioquímicos, glicemia em jejum (de seis horas), triglicerídeos e colesterol total, e a sensibilidade periférica à insulina foram avaliados no primeiro e no último dia de tratamento com Liraglutido. Após o tratamento e sacrifício dos animais, foram realizadas curvas cumulativas CR de relaxamento isométrico ao SNP e à NA (0,01 μM - 631 μM) em tiras de fundo de estômago isolado de ratos Wistar e GK tratados e não tratados com Liraglutido e pré-contraídas com carbacol 5 μM. Comprovámos que este GLP-1RA induziu melhorias no perfil glicémico e lipídico e na sensibilidade periférica à insulina nos animais diabéticos sujeitos ao fármaco, e também, redução da ingestão calórica e perda de peso nos ratos tratados. Portanto, estes resultados são bons indicadores dos efeitos benéficos dos GLP-1RA para o tratamento da diabetes tipo II e da obesidade. Quanto à resposta contrátil do órgão isolado, uma diminuição no relaxamento induzido pelo SNP foi observada em ratos Wistar e GK tratados com Liraglutido (este efeito foi mais acentuado nos animais controlo). A perda de eficácia do efeito do SNP com o tratamento pode resultar de um possível efeito do Liraglutido na diminuição da libertação ou na degradação do óxido nítrico, sendo que um efeito direto do GLP-1RA sobre a síntese deste neurotransmissor é improvável, uma vez que não foram observadas alterações significativas na expressão da nNOS e da p-nNOS em lisados de fundo gástrico isolado de ratos controlo e diabéticos, tratados e não tratados com Liraglutido. Além disso, é possível que os GLP-1RA atuem por via da ativação da eNOS, em detrimento da nNOS. Deste modo, a redução da expressão do GLP-1R, como foi demonstrada em ratos Wistar e GK tratados com Liraglutido, pode resultar numa redução da ativação da eNOS, o que por sua vez, resultaria numa diminuição da síntese e da libertação de óxido nítrico e na consequente inibição do relaxamento do músculo liso gástrico. De fato observou-se imunomarcação do GLP-1R em células endoteliais de vasos sanguíneos co-localizados no plexo nervoso deste órgão. Contudo, há que salientar que não foram observadas alterações significativas na curva CR ao Liraglutido na presença de L-NNA, um inibidor não seletivo da NOS. Sobre a redução da expressão do GLP-1R em fundo gástrico isolado de ratos tratados com Liraglutido, esta pode ser consequência de uma possível internalização do GLP1-1R induzida por uma estimulação prolongada por parte do GLP-1RA. Além disso, também é possível que a perda de peso e a inibição do apetite observada nos ratos tratados com Liraglutido resulte num aumento da secreção de GLP-1 e consequente diminuição da expressão de GLP-1R (mecanismo de feedback negativo). O efeito do SNP é equipotente em ratos Wistar tratados e não tratados com Liraglutido, no entanto, foi observada perda de potência do efeito relaxante do SNP em animais diabéticos tratados com o GLP-1RA, sendo que esta pode ser explicada pela perda de neurónios nitrérgicos, como consequência da diabetes tipo II, e deste modo, diminui o relaxamento por diminuição da síntese e libertação de óxido nítrico endógeno. De facto no nosso estudo observou-se uma tendência para diminuição da expressão da nNOS e/ou p-nNOS no rato GK, relativamente ao rato Wistar. No caso da noradrenalina, foi observada uma perda significativa de potência relativamente à situação controlo, determinada quer pela patologia, quer pelo tratamento. Sendo que a perda de potência da noradrenalina com o tratamento pode relacionar-se com a sub-regulação da expressão do GLP-1R observada nos ratos tratados com Liraglutido, o que por sua vez, pode resultar numa redução da ativação de vias nervosas adrenérgicas. Enquanto a perda de potência da noradrenalina com a patologia pode ser explicada por uma possível sub-regulação da expressão de recetores beta-adrenérgicos em fundo gástrico isolado de rato diabético. Em ambos os casos, a ação da NA estaria diminuída, assim como, o relaxamento induzido por esta. Por fim, a imunomarcação do GLP-1R foi detetada nas células parietais das glândulas gástricas, nas células musculares lisas, nas células ganglionares do plexo nervoso e nas células endoteliais dos vasos sanguíneos, em fundo gástrico isolado de rato. Finalmente, a realização de novos estudos é necessária para compreender melhor a real contribuição do óxido nítrico no mecanismo de ação subjacente ao efeito dos GLP1-RA sobre a motilidade gástrica. E além disso, o uso de animais diabéticos com uma idade mais avançada, ou até mesmo o uso de um outro modelo animal de diabetes tipo II, poderia ajudar a entender melhor as alterações promovidas pela patologia na motilidade gástrica.

Glucagon-like peptide I (GLP-1) has been studied in the development of new therapeutic strategies for the treatment of type II diabetes because of its metabolic effects, like stimulation of insulin secretion induced by nutrients (incretin effect), stimulation of insulin biosynthesis, inhibition of glucagon secretion and improvement of beta-cell function. GLP-1 also promotes cardioprotection, induces satiety, delays gastric emptying, inhibits acid gastric secretion and inhibits gut motility through activation of GLP-1R on enteric neurons and via nitric oxide release. GLP-1R agonists (GLP-1RA) are drugs that mimic the effects of GLP-1 and they are resistant to enzymatic degradation by DPP-IV. GLP-1RA have also been used in the treatment of obesity because of its significant effects in inhibition of appetite and weight loss. The main aim of this project was to study the effects of GLP-1RA, GLP-1 and Liraglutide, in gastric motility and its alterations in the presence of type II diabetes. To this end, gastric fundus strips from Wistar rats (control group) and Goto-Kakizaki rats (GK rat, animal model of spontaneous type II diabetes and non-obese), with sixteen weeks of age, were used in functional studies. Isometric contractile cumulative concentration-response (CR) curves for GLP-1RA were performed (0,05 nM - 111,1 nM) and all gastric fundus strips were pre-contracted with carbachol 5 μM. Both GLP1-RA induced concentration-dependent, non-cholinergic and tonic contraction of isolated rat gastric fundus. GLP-1 was the most effective in GK rat (compared to Wistar rat) and both GLP-1RA were equivalent in Wistar rat. Inversely, Liraglutide was the most potent in the control group and both agonists were equipotent in diabetic rats. Comparing both animal models, GLP-1 was more effective in diabetic rats than in control rats. This increased efficacy of GLP-1 in diabetic rats can be explained, in part, by the tendency of up-regulation of the GLP-1R expression determined, by Western Blotting, in lysates from isolated gastric fundus from GK rat (compared to Wistar rat). This increased GLP-1R expression can be promoted by type II diabetes and can result from a compensation mechanism since a reduction in plasma and post-prandial levels of GLP-1 was reported in GK rat (compared to Wistar rat). xvi For pharmacological characterization of the contractile response to GLP-1RA, second cumulative CR curves for GLP-1 in gastric fundus strips from Wistar rats were performed in the absence and in the presence of Exendin-3, 300 nM (selective GLP-1R antagonist) and cumulative CR curves for Liraglutide were performed in the absence and in the presence of NG-nitro-L-Arginine, 250 μM (L-NNA, non-selective inhibitor of nitric oxide synthase). Both (Exendin-3 and L-NNA) were added to the organ bath thirty minutes before the CR curves. The GLP-1R antagonist, Exendin-3, caused a statistically significant (p <0,05) reduction of the contractile response induced by GLP-1, without changes in potency, so we can conclude that contraction of gastric fundus induced by GLP-1RA is partially mediated by its specific receptor. No significant alterations in contractile response to Liraglutide were observed in the absence and in the presence of inhibitor L-NNA, therefore gastric fundus contraction induced by GLP-1RA is independent of nitric oxide synthase. To better understand the contractile response to GLP-1RA, the effect of the treatment with Liraglutide in isometric relaxation induced by a nitric oxide donor, sodium nitroprusside (SNP) and by noradrenaline, in isolated gastric fundus from Wistar and GK rats was evaluated. To this end, Wistar and GK rats with fourteen weeks of age were divided into four groups: Wistar and GK rats treated with Liraglutide (200 μg/kg s.c.) twice daily and for fourteen days; and Wistar and GK rats treated with saline (NaCl 0,9% s.c.) during the same period. Body weight and caloric intake were evaluated daily and weekly, respectively. Biochemical analyses (fasting glycaemia, triglycerides and total cholesterol) and insulin tolerance evaluation were performed on the first and on the last day of the treatment. After treatment with Liraglutide, cumulative CR curves for SNP and NA were performed (0,01 μM - 631 μM) and all gastric fundus strips from Wistar and GK, treated and non-treated, rats were pre-contracted with carbachol 5 μM. We proved that Liraglutide induced an improvement of biochemical profile and peripheral insulin tolerance in diabetic rats, and also, a significant decrease in caloric intake and body weight in treated-rats. Therefore, we can conclude that GLP-1RA are beneficial for the treatment of type II diabetes and obesity. xvii A decrease in relaxation induced by SNP was observed in Wistar and GK rats treated with Liraglutide and this effect was more significant in Wistar rats. The loss of efficacy of SNP effect determined by the treatment with Liraglutide can be explained by a possible effect of this GLP-1RA in reduction of release or in degradation of nitric oxide. A direct effect in nitric oxide synthesis is unlikely to occur because no significant alterations were observed in nNOS and p-nNOS expression in isolated gastric fundus from treated and non-treated rats. Besides that, if GLP1-RA could act through eNOS activation, instead of nNOS, a reduction in GLP-1R expression (demonstrated, in this study, in Wistar and GK rats treated with Liraglutide) could result in a reduction of eNOS activation and consequently, in a reduction of nitric oxide release and relaxation of gastric smooth muscle. In fact GLP-1R was detected (by immunohistochemical studies) in endothelial cells of blood vessels co-localized in nervous plexus of gastric fundus. But no significant alterations were observed in CR curves to Liraglutide in the presence of L-NNA (a non-selective inhibitor of NOS). About the significant reduction of GLP-1R expression in isolated gastric fundus from rats treated with Liraglutide (compared to non-treated rats), it can be explained by a compensation mechanism between a probable increase of plasmatic levels of GLP-1 induced by weight loss and inhibition of appetite and the reduction of GLP-1R expression in treated-rats (negative feedback mechanism). Besides that, it’s possible that Liraglutide could promote GLP-1R internalization induced by a prolonged stimulation to this GLP1-RA. SNP was equipotent in Wistar treated and non-treated rats, but a loss of potency of SNP effect was observed in diabetic and treated-rats and it can be explained by the fact that diabetes promotes loss of nitrergic neurons and subsequent reduction of nitric oxide synthesis and release, so relaxation of gastric smooth muscle is inhibited. In fact, in our study, a tendency to decreased nNOS and p-nNOS expression in lysates from gastric fundus was observed in GK rat (compared to Wistar rat). Noradrenaline was less potent in Wistar and GK rats treated with Liraglutide, indicating loss of potency with the treatment. Comparing control and diabetic rats, NA was significantly less potent in GK rat, suggesting loss of potency determined by type II diabetes. Loss of potency of noradrenaline with the treatment can be related to the down-regulation of GLP-1R expression in gastric fundus from treated-rats, since GLP1-1RA can act xviii through GLP-1R and subsequent sympathetic adrenergic pathways activation. In this case, a decrease in GLP-1R expression could result in a decrease in activation of sympathetic adrenergic pathways and consequently, in inhibition of noradrenaline action. Loss of potency of NA with the pathology can be explained by a possible down-regulation of beta-adrenergic receptors in gastric fundus induced by type II diabetes and therefore, noradrenaline action would be reduced and also relaxation induced by NA. Finally, GLP-1R immunoreactivity was observed in parietal cells of gastric glands, in smooth muscle cells, in ganglion cells of nervous plexus and in endothelial cells of blood vessels, in isolated rat gastric fundus. To conclude, new studies are necessary to better understand the real contribution of nitric oxide in the action mechanism of GLP-1RA effect in gastric motility. And the use of older diabetic animals or even using another animal model of type II diabetes could help understanding gut motility alterations caused by diabetes.