Desenvolvimento de uma técnica de HPLC para a quantificação de colistina em plasma humano e a sua monitorização sérica em doentes internados no CHUC

Abstract

A Colistina é um antibiótico catiónico polipeptídico constituído por pelo menos 30 componentes, dos quais se destacam a Colistina A e a Colistina B, e possui 5 grupos amina primários que lhe conferem características básicas. Na prática clínica é administrada como tratamento de última linha para infeções por bactérias Gram-negativo multirresistentes, sob a forma de colistimetato de sódio, um profármaco aniónico e instável, que é rapidamente hidrolisado em Colistina, o metabolito farmacologicamente ativo. Hoje em dia, o desenvolvimento de resistência bacteriana à Colistina é uma realidade, principalmente pelas bactérias Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoneae. Deste modo, é de extrema importância a monitorização terapêutica da Colistina, não só pelo aumento constante das resistências antibacterianas, como também pela toxicidade desencadeada por este fármaco que, desde cedo, suscitou preocupação pelos profissionais de saúde. No Centro Hospitalar da Universidade de Coimbra, E. P. E. (CHUC, E. P. E.), a utilização deste fármaco tem vindo a crescer novamente, sendo que para a sua monitorização no plasma, é necessário recorrer a uma técnica sensível e seletiva, que atualmente ainda não se encontra disponível. O objetivo principal do presente trabalho consistiu em desenvolver e validar uma técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) que quantificasse, com exatidão e precisão, a Colistina em plasma humano, sendo posteriormente utilizada na monitorização sérica do mesmo fármaco em doentes internados no CHUC, E. P. E.. Deste modo, com esta técnica poder-se-á, no futuro, determinar as concentrações séricas de cada doente e a cinética da Colistina para individualizar o seu regime posológico, visando aumentar a eficácia e segurança do tratamento das infeções, ao mesmo tempo que se combate as resistências hospitalares. A separação cromatográfica da Colistina A e B e do padrão interno (PI; cloridrato de anfetamina) foi alcançada em menos de 17 minutos, com recurso a uma coluna C18 de fase reversa a 30°C pela aplicação de um programa de eluição por gradiente utilizando uma fase móvel constituída por acetonitrilo (A) e água ultrapura (B). A deteção foi feita nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 343/500 nm. A curva de calibração foi linear (r2=0,993) na gama de concentrações de 0,09-9,0 μg/mL e o limite de quantificação foi definido como sendo 0,09 μg/mL. A precisão global não ultrapassou os 13,85% e a exatidão variou entre os -3,83 e 14,49%. 14 A técnica de HPLC desenvolvida e apresentada nesta dissertação, permitiu a quantificação da Colistina em amostras plasmáticas de doentes, sem interferência dos fármacos concomitantemente administrados.

Colistin is a basic cationic polipeptidic antibiotic constituted by, more than 30 components, including Colistin A and Colistin B highlight. In the clinical practice is administrated in the for of sodium colistimethate (CMS) as the last treatment line against multidrug resistant Gram-negative bacteria infection. CMS is an anionic and instable prodrug, that is rapidly hidrolised into Colistin, the pharmacologic active metabolite. Nowadays, the Development of bacterial Resistance against Colistin is a reality, mostly for Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoneae bacterias. Thus, the therapeutic monitoriting of Colistin is extremely important, due to the constant growth of the antibacterial resistance and the Colistin triggered toxicity, which early concerned the health profissionals. In Centro Hospitalar da Universidade de Coimbra, E. P. E. (CHUC, E. P. E.), the use of this drug has been growing. It’s serum monitoring, is essencial and to afford it a sensitive and selective technique is required. The main objective of the present work consisted in the development and validation of an high performance liquid chromatography (HPLC) technique that quantified, with precision and accuracy, Colistin in human plasma, and it’s further application in the serum monitorization hospitalized patients in CHUC, E. P. E.. Thus, this technique will be able, in the future, to determine the serum concentration of each patient and the Colistin’s kinetic will be applied to individualize the dosing regimen, to improve the efficacy and the safety of infections treatment and, at the same time, fight against the hospital resistences. Chromatographic separation of Colistin A and B and the internal standard (IS; amphetamine hydrochloride) was achieved in less than 17 minutes on a reverse phase C18 colunm at 30°C by applying a gradient elution program using a mobile phase constituted of acetonitrile (A) and ultrapure water (B). The detector was set at excitation/emission wavelengths of 343/500 nm. The calibration curve was linear (r2=0,993) in the concentration range of 0,09-9,0 μg/mL and the quantification limit was established at 0,09 μg/mL. The overall precision did not exceed 13,85% and the accuracy was within -3,83 e 14,49%. The high performance liquid chromatography with fluorescence detection developed and here presented in this dissertation, allowed the Colistin quantification in patient’s plasmatic samples, without interferance from the coadministrated drugs.