Title: Identification of candidate genes associated with primary congenital glaucoma in patients negative for CYP1B1 mutations
Authors: Carmona, Susana Margarida Martins 
Keywords: primary congenital glaucoma;exome sequencing;mutation;candidate gene
Issue Date: 1-Jun-2017
Citation: CARMONA, Susana Margarida Martins - Identification of candidate genes associated with primary congenital glaucoma in patients negative for CYP1B1 mutations. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/36509
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/90445/2012/PT 
Abstract: Primary congenital glaucoma (PCG) is a optic neuropathy characterized by high intra-ocular pressure (IOP) due to isolated trabeculodysgenesis during the neonatal or early infantile period. Classified as a rare disease in non-consanguineal populations, PCG assumes particular relevance in consanguineal populations, being one of the leading causes of blindness in children. The first genetic studies identified loci GLC3A, GLC3B, and GLC3C as associated with PCG and CYP1B1 as a causative gene. Posterior studies confirmed involvement of CYP1B1. In fact, mutations in this gene are the principal genetic cause of PCG,. However, a significant number of patients remain without identification of the genetic cause. Several studies have tried to discover new mutated genes in these patients, but only a few cases associated with LTBP2, MYOC, FOXC1, and TEK have been reported. In this work, a Portuguese group of 37 PCG patients was studied for the genetic cause behind PCG development. The search for CYP1B1 mutations revealed a high number of patients with CYP1B1 mutations, consistent with the recessive inheritance model. Nine previously reported CYP1B1 mutations (p.179RfsX18, p.R355HfsX69, p.T404SfsX30, p.D449MfsX8, p.L378Q, p.E387K, p.P437L, p.R444X, and R468_S476dup) were found in sixty-five percent of the patients. No mutations were identified in the non-coding regions of this gene. The negative CYP1B1 patients were then sequenced for the whole exome to identify new PCG causal genes. Another negative CYP1B1 patient with congenital glaucoma and other symptoms was also sequenced. Rare and predicted pathogenic exonic and splice site variants, with the exclusion of synonymous variants, were selected. Analysis of the PCG candidate genes revealed the novel TEK p.V188G heterozygous variant in patient 4. Experimental validation proved its pathogenicity involving a reduction of protein expression due to formation of aggregates that are degraded by the ubiquitin-proteasome pathway, and a reduction of autophosphorylation. Patient 4 also had the MYOC p.A445V variant that in addition to the pathogenic TEK variant may be determinant for PCG phenotype. The second search approach was based on the recessive inheritance model accepted for PCG. The homozygous RNASEH2C c.G468T variant was found in patient 31. This variant was predicted to disrupt exon 3 donor splice site. RNASEH2C is a causative gene of Aicardi-Goutières syndrome, a rare early-onset encephalopathy that usually results in severe intellectual and physical handicap. Congenital glaucoma is one of the associated phenotypes. Since mild forms of the disease have been described and are compatible with symptoms presented in patient 31, it was hypothesized that RNASEH2C c.G468T variant might be causative of the phenotype of this patient. However, the experimental study of the RNASEH2C altered transcript did not reveal significant differences comparatively to the wild-type. The BCOR p.S1298F and the TNC p.R103H and p.V295M variants were identified in patient 33 and patient 41, respectively. BCOR is related with ocular syndromes, and TNC encodes a component of the trabecular meshwork, the structure involved in PCG pathogenesis. The absence of strong candidates for all samples conducted to the analysis based on the dominant inheritance model. A possible digenic model involving S1PR3 and MMP1 or NEDD4 was found for patient 1. The novel p.R596T in TRPM3, a gene proposed to have an impact in IOP, was identified in patient 25. Patient 45 had the novel ABCC4 p.G529E variant. This gene is expressed in HTM cells and participates in IOP regulation. Secondary forms of congenital glaucoma and other ocular conditions resembling some of the PCG symptoms may lead to the incorrect diagnosis of PCG. In these situations, genetic information can be useful to reach the accurate diagnosis. Genes related to these specfic conditions were selected and evaluated. An additional patient with ocular and non-ocular features, suggestive of a syndrome associated with secondary congenital glaucoma, was also studied. In fact, the presence of the novel de novo FOXC1 p.Y64X in this patient confirmed the secondary cause of congenital glaucoma related to Axenfeld-Rieger syndrome. In the remaining patients, only p.Q309H in ELP4 could be associated with phenotype of patient 25. The absence of a commonly mutated gene in the majority of the samples suggests the heterogeneity of PCG and the existence of other genetic mechanisms involved in PCG pathogenesis. Still, this study contributed not only to the confirmation of TEK in PCG pathogenesis as also to the identification of possible candidate genes that, in the future, may be confirmed as contributing to PCG development. The identification of new genes will lead a deeper comprehension of the molecular mechanisms behind PCG pathogenesis, increasing the possibility of development of new effective PCG therapeutic approaches.
O glaucoma congénito primário (GCP) é uma neuropatia ótica que se caracteriza por um aumento da pressão intraocular (PIO) devido a uma trabeculodisgénese durante o período neonatal ou início do período infantil. Apesar de ser considerada uma doença rara em populações não consanguíneas, o GCP assume especial relevância em populações consanguíneas, sendo uma das principais causas de cegueira infantil. Os primeiros estudos genéticos desta doença identificaram os loci GLC3A, GLC3B, e GLC3C e o gene causal CYP1B1. Mutações no gene CYP1B1 revelaram ser a principal causa genética de GCP,. Contudo, um número significativo de doentes permanece sem causa genética conhecida. Vários estudos têm sido desenvolvidos com o intuito de descobrir novos genes mutados nestes doentes, mas apenas foram descritos alguns casos associados aos genes LTBP2, MYOC, FOXC1 e TEK. No decorrer deste trabalho, 37 doentes com GCP foram estudados para caracterização genética da doença. A pesquisa de mutações no gene CYP1B1 identificou um elevado número de doentes com mutações. Nove mutações já descritas (p.179RfsX18, p.R355HfsX69, p.T404SfsX30, p.D449MfsX8, p.L378Q, p.E387K, p.P437L, p.R444X, e R468_S476dup) foram encontradas em 65% dos doentes, seguindo o modelo de doença autossómica recessiva. Não foram detetadas mutações nas regiões não codificantes. De forma a identificar as causas genéticas do GCP nestes doentes sem mutações no gene CYP1B1, procedeu-se à sequenciação dos seus exomas. Um doente negativo para mutações no CYP1B1 e com outros sintomas para além de GCP foi igualmente estudado. Numa fase inicial da análise, as alterações exónicas e de splicing, raras e previstas como patogénicas, foram selecionadas e as sinónimas excluídas. Uma primeira abordagem baseada na pesquisa de alterações nos genes candidatos identificou no doente 4 a alteração nova p.V188G no gene TEK, em heterozigotia. Estudos experimentais confirmaram a patogenicidade desta alteração através da diminuição da expressão da proteina, formação de agregados, posteriormente degradados pela via ubiquitina-proteasoma, e uma redução da auto-fosforilação. Este doente revelou ainda a alteração p.A445V no gene MYOC, que na presença da alteração do gene TEK poderá ter impacto para o desenvolvimento do GCP neste doente. A segunda abordagem teve por base o modelo recessivo aceite para o CGP. Seguindo esta estratégia, no doente 31 foi identificada a alteração c.G468T no gene RNASEH2C, prevista como levando à perda do dador de splicing do exão 3. Este gene está associado ao desenvolvimento do síndrome de Aicardi-Goutières, uma encefalopatia severa o associada por vezes a glaucoma congénito. Formas mais ligeiras da doença já foram descritas, sendo essas compatíveis com os sintomas do doente 31. Assim sendo, considerou-se a hipótese desta alteração estar associada ao fenótipo do doente 31. Contudo, a validação experimental não revelou diferenças entre os transcriptos com e sem a alteração. Outros dois genes identificados com alterações foram o gene BCOR com a alteração p.S1298F no doente 33 e o gene TNC com as alterações p.R103H e p.V295M no doente 41. BCOR está associado a fenótipos oculares, enquanto TNC codifica um dos componentes da malha trabecular, a principal estrutura ocular envolvida no GCP. A ausência de um forte gene candidato para todas as amostras conduziu a uma análise baseada no modelo dominante. No doente 1 foi identificado um possível modelo digénico envolvendo os genes S1PR3 e MMP1 ou NEDD4. A alteração p.R596T no gene TRPM3 foi identificada no doente 25 e o doente 45 apresentou a alteração p.G529E no gene ABCC4. Ambos os genes foram descritos como envolvidos na regulação da PIO. O diagnóstico de glaucoma secundário ou de doenças com características semelhantes aos do CGP é por vezes difícil, podendo levar a um diagnóstico não assertivo de CGP. Nestas situações, os dados genéticos podem auxiliar o diagnóstico clínico. Assim sendo, genes associados a estas doenças foram avaliados. Um doente com glaucoma congénito e outros sintomas indicativos de um sindrome associado a glaucoma secundário foi também estudado. Esta suspeita foi confirmada com a identificação da nova alteração de novo p.Y64X no gene FOXC1, indicativa do síndrome de Axenfeld-Riger. Relativamente aos restantes doentes, a alteração p.Q309H no gene ELP4 poderá ter impacto no fenótipo do doente 25. A ausência de um gene mutado comum à maioria dos doentes sugere a heterogeneidade do GCP, bem como o envolvimento de outros mecanismos genéticos. Ainda assim, este estudo permitiu a confirmação do envolvimento do gene TEK no GCP, bem como a identificação de possíveis genes candidatos, que, no futuro, poderão revelar-se como tendo um papel importante no desenvolvimento do GCP. A identificação de novos genes permitirá uma compreensão mais extensa dos mecanismos moleculares inerentes ao GCP, o que aumentará a possibilidade de desenvolvimento de novas terapias.
Description: Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, na especialidade de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/36509
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:FMUC Medicina - Teses de Doutoramento

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