Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/36427
Title: Downstream process development of novel valuable bio-therapeutics
Authors: Moreira, Ana Sofia da Costa
Orientador: Lisboa, Cristina Maria da Costa Peixoto
Moreira, João Nuno
Keywords: Interferometria; Mucinas; Cromatografia; Factores biológicos; Biofarmacêutica
Issue Date: Sep-2016
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: The development of novel recombinant Virus-like particles (VLPS) has been putting the spotlight in vaccine’s biomanufacturing. However, establishing purification and quantification methods for complex therapeutic products with a short time to market represents an engineering challenge. The first aim of this work was to use BLI technology to improve mucin detection and quantification in a fast, simple and label free way. The experiments were performed using streptavidin (SAX) biosensors that binds biotinylated lectins, which can recognize mucins carbohydrate structures. Two different mucins were detected and quantified: Bovine Submaxillary Gland Mucin (BSM) and human MUC5B mucin. Different assay conditions were optimized and the most suitable lectin, Aleuria aurantia lectin (AAL), was selected. Additionally, competition assay allowed the identification of the minimal concentration to inhibit AAL-mucin association. These results can be applied for future mucin purification improvement, for example, in affinity chromatography. The second part of this work reports the development and implementation of a flow-through purification strategy for Hepatitis C virus-like particles, using anion exchange chromatography. Exploratory evaluations were performed using scale-down tools, in one mL scout column. The results obtained allowed the translation to radial flow chromatography, an alternative to standard axial packed columns. The global recovery yield of the developed strategy was 66%. Impurity clearance efficiencies with a log reduction value of 2 and 1.4 for baculovirus and DNA, were achieved. Overall, valuable tools were reported and can be used to improved and optimized new and already established purification processes.
O desenvolvimento de novas partículas recombinantes semelhante a vírus (VLPs) tem colocado grande foco na produção de vacinas. Contudo, implementar métodos de purificação e quantificação para produtos terapêuticos complexos, de forma a entrarem rapidamente no mercado, representa um desafio significativo. O primeiro objetivo deste trabalho foi utilizar a tecnologia de Bio-layer interferometry (BLI) de modo a melhorar a deteção e quantificação de mucinas, de uma forma rápida, simples e sem recorrer ao uso de marcadores. O método foi implementado com recuso a biossensores de streptavidina (SAX), com afinidade para lectinas biotiniladas, que são capazes de reconhecer estruturas de hidratos de carbono existentes nas mucinas. Foram avaliadas, deteção e quantificação, duas mucinas distintas: a mucina da glândula submaxiliar bovina (BSM) e a mucina humana MUC5B. Depois de otimizadas diferentes condições foi selecionada a lectina mais adequada, Aleuria aurantia lectina (AAL). Adicionalmente, ensaios de competição permitiram a identificação da concentração mínima para inibir a associação AAL-mucina. Estes resultados podem ser aplicados futuramente, nomeadamente para otimizar a purificação de mucinas, por exemplo, em cromatografia de afinidade. A segunda parte deste trabalho descreve o desenvolvimento e implementação de uma estratégia de purificação por cromatografia em modo negativo para VLPs de Hepatite C, recorrendo a cromatografia de troca aniónica. Foram realizadas avaliações com o uso de materiais para escalas laboratoriais, em colunas de um mL. Os resultados obtidos permitiram a transição para cromatografia de fluxo radial, que representa uma alternativa às colunas tradicionais de fluxo axial. A percentagem da recuperação global do método desenvolvido foi de 66%. Quanto à remoção de impurezas foram obtidos log reduction values de 2 para baculovírus e 1.4 para DNA. No geral, foram referidas neste trabalho ferramentas de grande valor que podem ser utilizadas para melhorar e otimizar métodos de purificação novos e já existentes.
Description: Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/36427
Rights: embargoedAccess
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UC - Dissertações de Mestrado

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